付敏東，李成歡

汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院，廣東韶關(guān) 512026

八角茴香油的提取工藝及抗菌、抗氧化性作用

付敏東，李成歡

汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院，廣東韶關(guān) 512026

目的：研究八角茴香油的提取工藝、抗菌、抗氧化作用。方法：采用95%乙醇做溶劑,通過(guò)正交試驗(yàn)、體外抑菌試驗(yàn)、對(duì)DPPH-自由基清除能力試驗(yàn)分別對(duì)八角中的八角茴香油的提取工藝、抑菌作用、自由基清除能力等進(jìn)行研究。結(jié)果：試驗(yàn)結(jié)果表明，八角茴香與95%乙醇溶液比為1∶6，虹吸次數(shù)為6次，浸泡時(shí)間為2.4 h是八角茴香油的較佳提取工藝。八角茴香油濃度在15.62～62.50 mg/L時(shí)對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌及黑曲霉菌等呈中度敏感；對(duì)DPPH-自由基的清除能力隨著濃度的增加而增強(qiáng)。結(jié)論：采用乙醇回流提取八角茴香油工藝的較佳條件為A2B2C3，八角茴香油對(duì)細(xì)菌、真菌均有一定的抗菌作用和抗氧化性。

八角茴香油；提?。豢咕?；抗氧化

八角（Illicium verum Hook.f.）為木蘭科八角屬植物，又稱(chēng)八角茴香（《本草綱目》）、大茴香等，主產(chǎn)于我國(guó)；干燥的成熟果實(shí)入藥，為常用中藥，有祛風(fēng)理氣、和胃調(diào)中、溫陽(yáng)散寒、理氣止痛等功效[1-2]。而且其味之濃郁，常用于食品和藥物制劑的矯味和防腐。八角果實(shí)含揮發(fā)油、有機(jī)酸類(lèi)、黃酮類(lèi)、茴香醚、茴香醛等有效成分，具有抑菌作用[3]。近年來(lái)，科學(xué)家對(duì)天然植物的抗菌防腐作用進(jìn)行了深入研究并發(fā)現(xiàn)了不少新穎“植物抗菌素”，并從植物體內(nèi)的次生物質(zhì)中尋找能抑制有害生物的有效成分，用人工直接提取應(yīng)用或明確有效成分結(jié)構(gòu)后，人工合成制作新型抗生素成為新藥開(kāi)發(fā)熱點(diǎn)之一。同時(shí)開(kāi)發(fā)高效、無(wú)毒、安全的天然抗氧化劑，具有廣闊的前景[4]。筆者對(duì)八角的有效成分——八角茴香油的提取、抗菌及抗氧化性方面進(jìn)行了初步的研究，結(jié)果如下：

1 儀器與試藥

1.1 儀器

分析天平（上海TG328A，上海精密科學(xué)儀器）；753型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海第三儀器廠）；島津UV-240Z紫外分析儀；SXT-2索氏提取器 （上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司）；微量移液器（ThermoFish，芬蘭雷勃）；八角（廣州市藥材公司）；95%乙醇（藥用）；DPPH 自由基（Sigma，批號(hào)：S90790-379）。

1.2 供試菌種

金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、黑曲霉菌、酵母菌均由廣州工業(yè)微生物檢測(cè)中心提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝

2.1.1 供試驗(yàn)用八角原料的制備 將八角置于60℃烘箱中烘干，粉碎，過(guò)60目篩得，備用。

2.1.2 乙醇回流提取試驗(yàn)條件的篩選 采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將影響提取效率的主要因素：八角與95%乙醇的用量比例、索氏提取的虹吸次數(shù)、室溫下八角在95%乙醇中浸泡時(shí)間作為試驗(yàn)因子，進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)試驗(yàn)方案重復(fù)3次，每次投放供試用八角原料20 g，收集所得八角茴香油，計(jì)算八角茴香油的提取率，取3次試驗(yàn)值的平均值作為各試驗(yàn)方案的評(píng)價(jià)指標(biāo)。因素水平見(jiàn)表1。

2.1.3 八角茴香油提取 稱(chēng)取置于60℃烘箱中烘干，粉碎，過(guò)60目篩的八角原料20 g放入燒瓶，加入適量95%乙醇分別浸泡1.2、1.8、2.4 h，過(guò)濾，直接用過(guò)濾濾紙將過(guò)濾后的八角粉包成圓柱形，放入索氏提取器內(nèi)，用少量95%乙醇洗滌燒瓶2～3次，洗滌液和濾液一起全部集合在燒瓶，加入95%乙醇至預(yù)定量，加熱回流提取，回流至預(yù)定條件，停止加熱，自然冷卻，用傾瀉法將燒瓶中的提取液轉(zhuǎn)移到燒杯中，用少量乙醇洗滌燒瓶2～3次，合并提取液回收乙醇并濃縮。

2.1.4 鑒別 取“2.1.3項(xiàng)”下提取的八角茴香油1 ml，加無(wú)水乙醇2 ml，溶解得供試品溶液。①精密吸取該供試溶液2 μl點(diǎn)于以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，揮干，再點(diǎn)加間苯三酚鹽酸試液約2 μl，即顯粉紅色至紫紅色的圓環(huán)。②另精密吸取該供試溶液10 μl置10 ml量瓶中，加無(wú)水乙醇至刻度，搖勻，照分光光度法（《中國(guó)藥典》2010年版附錄ⅤA）測(cè)定，在259 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。

2.1.5 八角茴香油提取率 八角茴香油提取率（%）=八角茴香油重量/八角粉重量×100%。

2.1.6 試驗(yàn)與結(jié)果 根據(jù)表1選用L9（34）正交試驗(yàn)表研究提取工藝參數(shù)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

2.2 抑菌實(shí)驗(yàn)

2.2.1 抑菌試液的制備 以95%乙醇倍比稀釋?zhuān)　?.1.3項(xiàng)”下提取的八角茴香油配制成含生藥100%（即1 ml含1 g）的抑菌試液50 ml；另取倍比稀釋用的95%乙醇50 ml作抑菌對(duì)照試劑，備用。

表1 乙醇回流提取正交試驗(yàn)因素水平

表2 乙醇回流提取八角茴香油正交試驗(yàn)方案與結(jié)果（n=3）

2.2.2 菌懸液的制 配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、黑曲霉菌和酵母菌至試管斜面，25℃培養(yǎng)24 h活化，用滅菌注射用水洗下菌苔制成菌苔菌懸液，制成菌懸液，細(xì)菌使用平板計(jì)數(shù)法，霉菌、酵母菌使用顯微鏡直接記數(shù)法測(cè)菌體個(gè)數(shù)，調(diào)至濃度為含菌體為1.5×108cfu/L的菌懸液，備用。

表3 乙醇回流提取正交試驗(yàn)方差分析

2.2.3 抑菌濾紙片的制備 選擇吸水性強(qiáng)的濾紙，烘干，用打孔器制成若干直徑為6 mm的圓形紙片，高壓滅菌。在經(jīng)高壓滅菌干燥后的培養(yǎng)皿中倒入抑菌試液30 ml，用鑷子將濾紙片夾入浸泡12 h后后置于經(jīng)干燥滅菌的培養(yǎng)皿中，備用。

2.2.4 抑菌圈的測(cè)定[5]取制備好的抑菌濾紙片貼在含菌平板上，每皿貼3片。細(xì)菌置培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h，酵母菌置培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)48 h，霉菌置培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)1周。選取抑菌圈比較明顯的平板測(cè)定抑菌圈直徑，取3貼測(cè)定的抑菌圈直徑的平均值。95%乙醇作抑菌對(duì)照，同時(shí)設(shè)立滅菌注射用水陰性對(duì)照。結(jié)果：大腸埃希菌的抑菌圈直徑是14.21 mm，金黃色葡萄球菌是15.32 mm，酵母菌的抑菌圈直徑是15.01 mm，黑曲霉菌的抑菌圈直徑是11.10 mm。

2.2.5最低抑菌濃度（MIC）試驗(yàn) 采用兩倍稀釋法；分別取經(jīng)高壓滅菌試管8支，將抑菌試液1 ml以滅菌注射用水倍比稀釋成 0.5、0.25、 0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 g/ml。第7號(hào)管作為不加抑菌試液的對(duì)照管，第8號(hào)管只加抑菌試液1 ml作為不加菌懸液的對(duì)照管。在每個(gè)試管中加入9 ml瓊脂培養(yǎng)基，充分混勻，待完全凝固后用加樣器接種1 ml菌懸液，細(xì)菌置培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h，酵母置培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)48 h，霉菌置培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)1周。以肉眼觀察，以藥物最低濃度管無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)者為受試菌的MIC值（mg/L），所有試驗(yàn)均在不同日期重復(fù)3遍。結(jié)果：大腸埃希菌MIC是31.25，金黃色葡萄球菌MIC是15.625，酵母菌MIC是62.5，黑曲霉菌MIC是62.5。

2.2.6 抑菌圈的判定標(biāo)準(zhǔn)[6]抑菌圈直徑＞15 mm為最敏感，10～15 mm為中度敏感，7～9 mm時(shí)為低度敏感，無(wú)抑菌者為不敏感。

2.2.7 結(jié)果 八角茴香油濃度在15.62～62.50 mg/ml時(shí)對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌及黑曲霉菌等呈中度敏感，具有抗菌活性。

2.3 清除DPPH-自由基能力的測(cè)定[7]

精密稱(chēng)取DPPH·10 mg溶于100 ml無(wú)水乙醇，得儲(chǔ)備液，冰箱避光保存。用時(shí)稀釋4倍得6.5×10-5mol/L DPPH·溶液，按“表4”加樣，反應(yīng)30 min后1 cm比色皿517 nm下測(cè)定吸光值。重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。另將八角茴香油（待測(cè)抗氧化劑）用蒸餾水和70%乙醇分別配制成濃度0.03%、0.06%、0.09%、0.12%的系列溶液，分別按“表 4”加樣，反應(yīng)30 min后分別依次在517 nm下測(cè)定吸光值（n=3），取3次測(cè)定值的平均值分別計(jì)算清除率（%），所對(duì)應(yīng)的清除率分別為 23.15%、44.23%、60.12%、70.14%。

清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/Ao]×100%。

表4 DPPH實(shí)驗(yàn)加樣量

3 討論

3.1 對(duì)表2進(jìn)行數(shù)據(jù)處理

由直觀分析和方差分析可知，以八角茴香油取油量為評(píng)價(jià)指標(biāo) ，最佳提取工藝條件為 A2B2C3，各因素的主次順序?yàn)镃＞B＞A，但方差分析表明各因素對(duì)八角茴香油提取的量均無(wú)顯著影響（表3）?；谝陨戏治?，可確定本方案提取八角茴香油工藝的最佳條件為A2B2C3，即加乙醇倍量為6倍，虹吸次數(shù)為6次，浸泡時(shí)間為2.4 h。采用乙醇回流提取八角茴香油，提取出的有效成分較多，溶劑對(duì)環(huán)境和人體都安全而且用量較少，提取時(shí)間短；但優(yōu)選乙醇濃度對(duì)八角茴香油提取效率的影響還需要進(jìn)一步的探索；同時(shí)提取物在制備、儲(chǔ)存時(shí)存在提取物易揮發(fā)損失。劑量不易控制、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，要實(shí)際應(yīng)用于規(guī)模化生產(chǎn)還需要有相關(guān)的技術(shù)來(lái)解決。

3.2 八角茴香油對(duì)供試菌的抑菌分析

實(shí)驗(yàn)顯示，八角茴香油對(duì)金黃色葡萄球菌、酵母菌的抑菌直徑＞15 mm，屬最敏感，對(duì)大腸埃希菌、霉菌的抑制屬中度敏感，這表明八角對(duì)細(xì)菌和真菌均有很強(qiáng)的抑制作用。提取物對(duì)液菌種的MIC值表明八角對(duì)酵母菌、霉菌的抑菌濃度＞6.3%，大腸埃希菌＞3.1%，對(duì)金黃色葡萄球菌＞1.6%與提取物抑菌試驗(yàn)結(jié)果相吻合。對(duì)細(xì)菌的抑制作用較強(qiáng)，對(duì)真菌也有一定的抑制作用，但相對(duì)較弱，可見(jiàn)八角對(duì)各種菌都有比較強(qiáng)的抑制作用，它是一種天然的廣譜抗菌藥。當(dāng)然對(duì)在試驗(yàn)中采用八角茴香的醇提取液進(jìn)行室內(nèi)生化檢測(cè)試驗(yàn)，對(duì)某些含量較少但又有抑菌活性的物質(zhì)有可能難以表現(xiàn)出活性，應(yīng)該采用活性追蹤的方法對(duì)粗提液進(jìn)行進(jìn)一步的分離、純化以尋找或確定其主要或有效抑菌活性成分。對(duì)抗菌劑而言，離體條件下無(wú)效的提取液有可能會(huì)在活體上表現(xiàn)活性，因此，有必要對(duì)八角茴香的乙醇提取物進(jìn)行活體抑菌試驗(yàn)，以便于進(jìn)一步研究。八角茴香的乙醇提取物的抗菌譜、作用方式、作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

3.3 八角茴香油的抗氧化作用

試驗(yàn)結(jié)果表明，八角茴香的乙醇提取物對(duì)DPPH-自由基有明顯的清除作用，在試驗(yàn)區(qū)間，隨著濃度的增加，其對(duì)DPPH-自由基的清除能力也增強(qiáng)。關(guān)于DPPH·法檢測(cè)抗氧化活性相對(duì)于抗氧化能力的體內(nèi)測(cè)定方法而言，這種體外測(cè)定方法時(shí)間短，所需的經(jīng)費(fèi)較少，所需用的儀器設(shè)備較簡(jiǎn)單，在國(guó)內(nèi)外有著廣泛的應(yīng)用；但是在試驗(yàn)過(guò)程中存在一些條件選擇的差異，如初始濃度、反應(yīng)時(shí)間等[8-9]。

志謝：承蒙主任中醫(yī)師傅旭東對(duì)八角進(jìn)行鑒定，謹(jǐn)此致謝。

[1]中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志(第三十卷第一分冊(cè))[M].北京:科學(xué)出版社,1996:228.

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Extraction process of star anise oil and its antibacterial and antioxidative effects

FU Mingdong,LI Chenghuan
Yuebei People's Hospital Affiliated to Shantou University Medical College,Guangdong Province,Shaoguan 512026,China

Objective:To study the extraction process of star anise oil and its antibacterial and antioxidative effects.Methods:The extraction process,antibacterial effects and radicals scavenging ability of star anise oil in star anise were studied by the orthogonal test,in vitro antibacterial test and para-DPPH-radical scavenging ability test using 95%ethanol as the solvent.Results:The results showed that the best star anise oil extraction process was star anise to 95%ethanol solution ratio of 1∶6,siphon times of 6 times and soaking time of 2.4 hours.Star anise oil at the concentration of 15.62 to 62.50 mg/ml was moderately sensitive to escherichia coli,staphylococcus aureus,yeasts,aspergillus niger and others,and its para-DPPH-radical scavenging ability increased with the increasing concentration.Conclusion:The best conditions of star anise oil extraction process using the ethanol reflux are A2B2C3.Star anise oil has certain antibacterial and antioxidative effects on bacteria and fungi.

Star anise oil;Extraction;Antibacterial;Antioxidative

R282.71

A

1673-7210（2011）12（a）-029-03

2011-05-24）