黃 微，劉 雪，劉少偉,﹡

（1.華東理工大學(xué)，上海200237；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京100083）

不同條件下Camembert奶酪中無毒害李斯特菌空間生長分布

黃 微1，劉 雪2，劉少偉1,﹡

（1.華東理工大學(xué)，上海200237；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京100083）

研究了在Camembert奶酪成熟過程中無毒害李斯特菌存活和生長的能力。用含有5lg CFU/mL無毒害李斯特菌的巴氏滅菌全脂牛奶精心制備Camembert奶酪。所有Camembert奶酪在以下三種情況下成熟：室溫（約20℃）和相對(duì)濕度60%（36h）；12℃、相對(duì)濕度93%（2周）；7℃、相對(duì)濕度85%（3周）。在成熟過程中，分別在1、5、10、15、20、25、30、35d時(shí)，利用選擇性培養(yǎng)基對(duì)奶酪表面和內(nèi)部的無毒害李斯特菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，在成熟第1d時(shí)，無毒害李斯特菌數(shù)量為7.16lg CFU/g，比初始值的4.76lg CFU/g增加了2.40lg CFU/g；而在第20d時(shí)，無毒害李斯特菌數(shù)量降低至6.54lg CFU/g；在第35d時(shí)，李斯特菌數(shù)量增加至7.38lg CFU/g?？傮w而言，無毒害李斯特菌在奶酪表面的生長快于中心位置。

無毒害李斯特菌，Camembert奶酪，成熟，存活，生長

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巴氏殺菌牛奶、培養(yǎng)基 市場購得；L.innocua、L.monocytogenes菌種保藏中心提供；酵母提取物 喝彩食品有限公司；大豆酪蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基 上海振宇化工科技有限公司。

離心機(jī)Super T21 Sorvall 美國Newton公司；均質(zhì)機(jī)bilon-08 上海比朗儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種培養(yǎng) 將L.innocua保存在含0.6%的酵母提取物的胰酶解大豆酪蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基斜面中，儲(chǔ)存在4℃下，每個(gè)月進(jìn)行再次培養(yǎng)。接種前，使L.monocytogenes在150mL含0.6%的酵母提取物的大豆酪蛋白胨瓊脂溶液中于37℃下培養(yǎng)24h，然后在4℃下用離心機(jī)以3300×g離心25min。傾倒出上清液，將細(xì)胞再次放入150mL 0.1%的蛋白胨水中以獲得8lg CFU/mL的活性細(xì)胞群，接種到被污染的巴氏殺菌牛奶中。

1.2.2 Camembert奶酪的制備 本研究所有制備卡門貝爾奶酪的原料奶都經(jīng)過巴氏殺菌，牛奶由超市購買，將24h菌齡的無害李斯特菌添加到牛奶中，使菌體含量達(dá)到之前所述的104～106CFU/mL。

1.2.3 制備奶酪所需的培養(yǎng)基和酶 奶酪制備用培養(yǎng)基從市場購買。培養(yǎng)基含有多種菌種：乳酸乳球菌乳酸亞種，乳酸乳球菌乳脂亞種，乳酸乳球菌乙酰乳酸亞種，明串珠菌乳脂亞種培養(yǎng)基儲(chǔ)存在-20℃的干燥環(huán)境中。

Pencillium candidum作為制備卡門貝爾奶酪的霉菌培養(yǎng)基。霉菌培養(yǎng)基也同樣儲(chǔ)存在-20℃的干燥環(huán)境中。先將600mg的霉菌培養(yǎng)基在1L的牛奶中溶解后，再加入到22L的牛奶中。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)室制備卡門貝爾奶酪 本實(shí)驗(yàn)中卡門貝爾奶酪制備需重復(fù)一次。在使用前，將直接接觸牛奶，奶酪凝乳液和干酪的所有儀器（如大桶，刀具，模具紗布）及鹽水，都經(jīng)高壓蒸汽滅菌以保證整個(gè)制備過程在無菌狀態(tài)下操作?？ㄩT貝爾奶酪的制備步驟如表1所示[6]。

表1 卡門貝爾奶酪典型制備及成熟數(shù)據(jù)列表

1.2.5 無害李斯特菌的計(jì)數(shù) 每一批實(shí)驗(yàn)，將三個(gè)含有無害李斯特菌的牛奶樣品（1mL）分別放入裝有20mL 0.1%無菌蛋白胨水中的100mL試管中。每塊接種無害李斯特菌的奶酪樣品放在400mL無菌振蕩均質(zhì)機(jī)內(nèi)，并添加20mL 0.1%無菌蛋白胨水。所有樣品在振蕩均質(zhì)機(jī)里混合2min。經(jīng)0.1%無菌蛋白胨水連續(xù)稀釋后，稀釋液通過MOX平板計(jì)數(shù)。所有平板在30℃下培養(yǎng)24h。最后，計(jì)數(shù)平板上由無害李斯特菌形成的典型菌落。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 此實(shí)驗(yàn)制備圓柱形卡門貝爾奶酪塊狀的大?。ㄖ睆?08mm，高32mm），如圖1所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)室制備卡門貝爾奶酪典型奶酪塊大小

實(shí)驗(yàn)用的奶酪塊狀的形狀和大小與市場上銷售的卡門貝爾奶酪一致。一次實(shí)驗(yàn)平行制備三批奶酪（如圖2所示），三批奶酪均使用含有無害李斯特菌的牛奶制備，根據(jù)成熟過程中的測(cè)定次數(shù)的不同，每批制備8塊奶酪。為了驗(yàn)證圓柱型奶酪的軸對(duì)稱性，將奶酪分割成120°的三個(gè)截面進(jìn)行測(cè)量，成熟過程中分別對(duì)每塊奶酪三個(gè)截面的無害李斯特菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。每個(gè)截面分成五個(gè)不同的測(cè)量位置，如圖3所示。選擇這些測(cè)量位置主要根據(jù)以下幾分方面：a.根據(jù)Radhakrishnan[12]的初步測(cè)定結(jié)果，無害李斯特菌存活和生長有明顯的區(qū)域差異；b.無害李斯特菌存活和生長的空間分布的確定，對(duì)數(shù)學(xué)模型的建立有積極的作用；c.成本和時(shí)間的約束。

圖2 一批卡門貝爾奶酪實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

圖3 測(cè)定無害李斯特菌存活和生長情況下樣品取點(diǎn)位置

卡門貝爾奶酪成熟4到5周后可進(jìn)行食用[12]?；谶@些考慮，本實(shí)驗(yàn)關(guān)于無害李斯特菌存活和生長的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案如表2所示。

表2 無害李斯特菌存活和生長實(shí)驗(yàn)方案

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 每次實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)都由Minitab software（Minitab 13，Minitab Inc.，State College，PA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有統(tǒng)計(jì)分析的檢驗(yàn)水平為0.05。根據(jù)一般線性模型對(duì)數(shù)值進(jìn)行比較，取測(cè)得的細(xì)菌數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)偏差值的平均值。

2 結(jié)果與討論

對(duì)三個(gè)批次的卡門貝爾奶酪成熟過程中的無害李斯特菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。其中每塊奶酪有三個(gè)截面，五個(gè)測(cè)量位置。

2.1 卡門貝爾奶酪制備中無害李斯特菌的存活情況

卡門貝爾奶酪由原料奶和巴氏殺菌牛奶制備。本實(shí)驗(yàn)中所有的巴氏殺菌牛奶都接種經(jīng)過24h培養(yǎng)的無害李斯特菌培養(yǎng)基。將1mL經(jīng)過24h培養(yǎng)的菌體培養(yǎng)基添加到22L的巴氏殺菌牛奶后，牛奶中無害李斯特菌的細(xì)胞數(shù)大約保持在105CFU/mL。在制備卡門貝爾奶酪的過程中，因?yàn)槠鹱优囵B(yǎng)基活性使pH下降，無害李斯特菌的生長得到抑制。但排出乳清后，無害李斯特菌在凝乳中得到了濃縮，結(jié)果導(dǎo)致干酪凝塊中無害李斯特菌數(shù)目升高到107CFU/g，如表3所示。

表3 奶酪制備過程中心上部（TC）無害李斯特菌菌落數(shù)情況（lg CFU/g）

2.2 卡門貝爾奶酪成熟過程中無害李斯特菌的存活情況

2.2.1 卡門貝爾奶酪成熟過程中無害李斯特菌存活的典型數(shù)據(jù) 成熟的前20d，所有奶酪塊中的無害李斯特菌總數(shù)逐漸減少，這主要是起子培養(yǎng)基活性降低了pH。第20d后，無害李斯特菌總數(shù)開始增長，這可能是由于奶酪中pH的升高[6]。Ramsaran等人[13]研究表明在卡門貝爾奶酪表面附近，因蛋白質(zhì)水解釋放氨，pH較高，細(xì)胞存活性較高。圖4為TC處無害李斯特菌存活和生長趨勢(shì)。

圖4 卡門貝爾奶酪成熟過程中TC位置無害李斯特菌存活和生長情況

通過卡門貝爾奶酪成熟過程中物理、化學(xué)和微生物性質(zhì)的變化可以幫助理解無害李斯特菌的生長情況。成熟35d后，pH趨于一個(gè)平穩(wěn)分布，這歸因于霉菌獨(dú)特的空間生長情況，霉菌在奶酪表面比在內(nèi)部能更好地存活和生長。因此，奶酪表面的pH比中心的要高。此外卡門貝爾奶酪成熟過程中還存在蛋白質(zhì)水解和酸化代謝[6]。

Lenoir[5]發(fā)現(xiàn)奶酪的表面特征導(dǎo)致P.camemberti的快速生長和表面霉菌產(chǎn)生的蛋白酶擴(kuò)散到奶酪里。由于起子培養(yǎng)基和P.camemberti反應(yīng)后的蛋白質(zhì)水解，蛋白質(zhì)水解或蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生了含氨物質(zhì)，導(dǎo)致低分子含氮化合物的形成[5]。隨著奶酪的成熟，在奶酪外皮和表面的氨濃度升高，這導(dǎo)致奶酪pH升高，同時(shí)乳酸代謝形成弱酸或其他化合物攜帶氫離子也會(huì)使pH升高。一般來說，低pH高溫可以導(dǎo)致病微生物高效失活。在前20d的成熟過程中，無害李斯特菌的生長受到低pH和高溫的影響。經(jīng)過后15d的成熟，奶酪放在具有較低溫度的冰箱中培養(yǎng)。細(xì)菌有了一個(gè)較利于存活和生長的環(huán)境。但因?yàn)榧?xì)菌不斷地恢復(fù)活性，細(xì)胞總數(shù)在第20d急劇下降。隨著菌體活性的完全恢復(fù)，無害李斯特菌群落在后續(xù)的成熟過程中繼續(xù)增加。

2.2.2 影響卡門貝爾奶酪成熟過程中無害李斯特菌數(shù)目的幾個(gè)因素

2.2.2.1 位置比較 每天成熟過程中，奶酪不同位置處菌體數(shù)有顯著性差異（P＜0.05）。圖5所示為5個(gè)菌數(shù)測(cè)定位置的菌體情況。

從測(cè)量數(shù)據(jù)可以看出，奶酪表面的菌落數(shù)（TS）高于奶酪中心的菌落數(shù)（見圖5），這可能是因?yàn)槟汤抑行牡膒H低而表面pH迅速升高的關(guān)系。TC，BC和 BS位置由于這三個(gè)位置相似的pH，無害李斯特菌生長速率相似?？傊?，奶酪塊中細(xì)菌總數(shù)在前20d中下降1個(gè)對(duì)數(shù)數(shù)量級(jí)，在之后持續(xù)的成熟過程中升高1個(gè)對(duì)數(shù)數(shù)量級(jí)。因?yàn)閜H低，奶酪中心位置的無害李斯特菌細(xì)胞生長率最低（C）。無害李斯特菌在中心上部位置（TC），中心下部位置（BC）和表面下部位置（BS）具有相似的生長速率，但TC處的無害李斯特菌菌落數(shù)比BC和BS位置的相對(duì)較高。這可能是因?yàn)樵谶@些位置具有相似的pH[6]。總之，所有奶酪塊的菌落數(shù)在前20d成熟過程中下降，而后在20～35d成熟過程中升高。

圖5 卡門貝爾奶酪成熟過程中無害李斯特菌存活和生長情況

2.2.2.2 批次和截面比較 每天每批次和截面的數(shù)據(jù)沒有顯著性差異（P＞0.05）。換句話說，在奶酪塊中無害李斯特菌有相同的存活和生長趨勢(shì)。結(jié)果顯示，任何截面的測(cè)量都可代表奶酪塊的測(cè)量數(shù)據(jù)。

2.2.2.3 成熟時(shí)間比較 不同的成熟時(shí)間對(duì)菌體數(shù)目存在顯著性差異（P＜0.05）。制備后，因低pH李斯特菌細(xì)胞數(shù)稍有降低。第1d所有奶酪塊的細(xì)胞數(shù)平均值為7.16lg CFU/g。20d的成熟后降到了6.54lg CFU/g，隨后在35d成熟時(shí)間后升高到7.38lg CFU/g（如圖5所示）。無害李斯特菌在奶酪中不能生長的原因?yàn)閜H較低，低pH降低了微生物的活菌數(shù)。在前20d的成熟過程中，奶酪中的pH低于5.5。在pH高于5.5時(shí)，無害李斯特菌菌數(shù)增加，這和之前報(bào)道過的文獻(xiàn)一致。

3 結(jié)論

3.1 由于細(xì)胞濃縮，凝乳比接種過的牛奶具有更高的細(xì)胞數(shù)目。接種過無害李斯特菌的牛奶有細(xì)菌4.76lg CFU/g，濃縮成凝乳后升高到7.16lg CFU/g。

3.2 前20d成熟過程中，因奶酪塊中的低pH，菌落數(shù)減少，其后在持續(xù)成熟過程中菌落數(shù)增加。

3.3 上表面區(qū)域（TS）具有較高的生長速率，然而，中心（C）區(qū)域生長速率較低。但是，中心頂部（TC），中心底部（BC）和表面底部（BS）區(qū)域具有相似的生長速率。

3.4 在批次和截面中無顯著性差異。但時(shí)間和位置對(duì)無害李斯特菌的存活和生長有顯著影響。

卡門貝爾奶酪成熟過程中無害李斯特菌存活和生長的數(shù)據(jù)可以建立一個(gè)動(dòng)態(tài)預(yù)測(cè)模型。

[1]Curiale,M S,C Lewus.Detection of Listeria monocytogenes in samples containing Listeria innocua[J].J of Food Prot，1994，57: 1048-1051.

[2]Foegeding,P M,N W Stanley.Listeria innocua transformed with and antibiotic resistance plasmid as thermal-resistant indicator for Listeria monocytogenes[J].J of Food Prot，1991，54（7）:519-523.

[3]Greenwood,M H D Robert,P Burden.The occurrence of Listeria species in milk and dairy products:A national survey in England and Wales[J].Int J Food Microbiology，1991,12:197-206.

[4]La?titia P,D Eliane,J C Cheftel.Inactivation of Listeria innocua in dairy fluids by pulsed electric fields:influence of electric parameters and food composition[J].Innovative Food Sci and Emerging Technology，2002（3）:357-369.

[5]Lenoir J.The surface flora and its role in the ripening of cheese[J].Int Dairy Federation，1984，171:3-20.

[6]Liu S,V M Puri.Spatial pH distributions during ripening of Camembert cheese[J].Trans of the ASABE，2005，48:279-285.

[7]MacDonald F,A D Sutherland.Important differences between the generation times of Listeria monocytogenes and Listeria innocua in two Listeria enrichment broths [J].J of Dairy Research，1994，61:433-436.

[8]Manuela V,F Fátima,S Manuela,et al.Is Listeria innocua 2030c,a tetracycline-resistant strain,a suitable maker for replacing L.monocytogenes in challenge studies with coldsmoked fish?[J].Food control，2001（12）:361-364.

[9]Margolles A,A Rodriguez,C G de los Reyes-Gavilán.Some chemical and bacteriological characteristics of regional cheeses from Asturias,Spain[J].J of Food Prot，1996，59:509-515.

[10]Margolles A,B Mayo,C G de los Reyes-Gavilán. Susceptibility of Listeria monocytogenes and Listeria innocua strains isolated from short-ripened cheeses to some antibiotics and heavy metal salts[J].Food microbiology，2001，18:67-73.

[11]Petran R L,K M J Swanson.Simultaneous growth of Listeria monocytogenes and Listeria innocua[J].J of Food Prot，1993，56: 616-618.

[12]Radhakrishnan S.Survival and growth modeling of Listeria monocytogenes during ripening of Camembert cheese[D].MS Thesis,Penn State University,University Park,PA.2000.

[13]Ramsaran H,J Chen,B Brunke,et al.Survival of bioluminescent Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157：H7 in soft cheese[J].Journal of Dairy Science，1998，81: 1810-1817.

The spatial growth distribution of Listeria innocua under various conditions of Camembert cheese

HUANG Wei1,LIU Xue2,LIU Shao-wei1,*
（1.Eastern China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China；2.China Agriculture University,Beijing 100083,China）

The ability of Listeria innocua to survive and grow during ripening of Camembert cheese was studied. Pasteurized whole milk containing about 5lg CFU/mL of L.innocua was used to elaborate in Camembert cheese.All cheeses were ripened in three stages:room temperature (about 20℃）and relative humidity 60% (36 hours)，12℃and relative humidity 93%(2 weeks)，7℃and relative humidity 85%(3 weeks).During ripening，surface and interior of cheeses were analyzed for population of L.innocua by surface plating on modified Oxford (MOX)agar.The data were collected on 1，5，10，15，20，25，30，35d during ripening.Results showed that population of L.innocua on the first day was around 7.16lg CFU/g which was 2.40lg CFU/g more than the initial inoculation of 4.76lg CFU/g.For subsequent 20 days，L.innocua population density declined to 6.54lg CFU/g. Thereafter，L.innocua population increased to 7.38lg CFU/g on 35d of ripening.Generally，the growth of L.innocua was faster in surface than in center location.

Listeria innocua；Camembert cheese；ripening；survival；growth

TS252.59

A

1002-0306（2011）10-0166-04

無毒害李斯特菌是一種革蘭氏陽性、不產(chǎn)生孢子、桿狀、嗜冷細(xì)菌、非溶血性及非致病的微生物[4]。兩種李斯特菌物種可在相同的自然環(huán)境下生長，通?？蓮陌褪蠝缇Ｄ獭④浤汤?、日常產(chǎn)品和其他食品中分離出來。先前已有幾篇文章研究了無害李斯特菌（L.innocua）的存活和生長情況。Margolles等[9]報(bào)道了在阿斯圖里亞斯（西班牙北部）地區(qū)，可以從短期成熟的奶酪中分離出L.innocua品種。Greenwood等[3]研究指出在軟質(zhì)牛奶奶酪中屢次發(fā)現(xiàn)L.innocua和L.monocytogenes（單增李斯特菌）。L.innocua已被成功作為評(píng)估熱處理過程對(duì)脫脂牛乳中L.monocytogenes的致死力的檢測(cè)[2]。目前，還沒有人研究在軟奶酪成熟過程中L.innocua的空間存活和生長情況。本文用類似于商業(yè)產(chǎn)品形狀的圓柱體Camembert奶酪來測(cè)量L.innocua的數(shù)量，此外，利用受污染的奶酪來測(cè)量L.innocua存活和生長的實(shí)際情況。因此，本文的研究目的一方面為測(cè)量Camembert奶酪在成熟過程中L.innocua存活和生長情況；另一方面評(píng)估和分析Camembert奶酪在成熟過程中L.innocua的空間分布狀態(tài)。

2010-09-03 *通訊聯(lián)系人

黃微（1986-），女，碩士，研究方向：低碳飲食。

上海市浦江人才計(jì)劃項(xiàng)目（09PJ1403700）；華東理工大學(xué)啟動(dòng)項(xiàng)目（YF0142122）。