呂 璐，石向群，鄭由敏，周凱鳳，孫利利

（九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 九江 332000）

高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方磺胺甲惡唑片中SMZ、TMP的含量

呂 璐，石向群，鄭由敏，周凱鳳，孫利利

（九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 九江 332000）

目的 建立測(cè)定復(fù)方磺胺甲惡唑片中磺胺甲惡唑（SMZ）和甲氧芐啶（TMP）含量的高效液相色譜（HPLC）法。方法 色譜柱C18（5 μm，4.6 mm ×150 mm），以0.03 mol/L磷酸（含0.2%三乙胺）-甲醇為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為 240 nm，柱溫 40℃，峰面積外標(biāo)法。結(jié)果 SMZ 在 20～100 μg/ml有良好的線性，r=0.993 1；TMP 在 4～20 μg/ml有良好的線性，r=0.996 6。結(jié)論 此法簡(jiǎn)單、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、結(jié)果準(zhǔn)確，可作為該片劑質(zhì)量控制的參考方法。

高效液相色譜法；復(fù)方磺胺甲惡唑片；SMZ含量；TMP含量

復(fù)方磺胺甲惡唑片是臨床常用的磺胺類抗菌消炎藥，其主要成分為磺胺甲惡唑（SMZ）和甲氧芐啶（TMP）。《中國(guó)藥典》（2000年版）采用等吸收雙波長(zhǎng)分光光度法對(duì)2組份分別進(jìn)行測(cè)定。另有文獻(xiàn)報(bào)道采用倍率減差雙波長(zhǎng)法、三波長(zhǎng)法、吸收度線性線合法、雙波長(zhǎng)比值光譜法等方法測(cè)定其含量，但均存在操作或計(jì)算較為繁瑣的缺點(diǎn)?，F(xiàn)采用高效液相色譜法，對(duì)2組份SMZ、TMP同時(shí)進(jìn)行測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

高效液相色譜儀（瓦里安Varian Prostar 230 SDM/325 UV）；液相工作站（Varian Star 6.4）；電子分析天平（賽多利斯Sartorius CP324S）；高速離心機(jī)（中佳HC-2518）；超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物）；無(wú)油隔膜真空泵（天津奧特賽恩斯）。

1.2 試藥

對(duì)照品：磺胺甲惡唑、甲氧芐啶（中國(guó)藥品生物鑒定所提供）；復(fù)方磺胺甲惡唑片（SMZ 0.4 g、TMP 0.08 g，湖北華中藥業(yè)有限公司生產(chǎn)）；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

1.3 步驟與條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱是Varian C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）；流動(dòng)相為甲醇：0.03 mol/L磷酸（含0.2%三乙胺）；以甲醇比例20%～60%梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm；流速1.0 ml/min；進(jìn)樣量 100 μl，定量環(huán) 20μl；柱溫 40℃；樣品分析時(shí)間 10 min。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的對(duì)照品SMZ 12.5 mg、TMP 2.5 mg置于25 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度。精密吸取對(duì)照品溶液0.4 ml、0.8 ml、1.2 ml、1.6 ml、2.0 ml分別置10 ml量瓶中，加甲醇使各容量瓶中溶液的體積為3 ml，加含20%甲醇的流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，配成標(biāo)1、標(biāo)2、標(biāo)3、標(biāo)4、標(biāo)5混標(biāo)溶液，以 15 000 r/min 離心 10 min，取上清液進(jìn)樣。

1.3.3 樣品溶液的制備 取復(fù)方磺胺甲惡唑10片，精密稱定，研細(xì)。精密稱適量(約相當(dāng)于SMZ 12.5 mg、TMP 2.5 mg)置25 ml量瓶中，加甲醇適量，經(jīng)超聲處理15 min后，加甲醇稀釋至刻度。搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液1.6 ml，置10 ml量瓶中，參照2.2方法定容、離心、進(jìn)樣。

2 結(jié)果與討論

2.1 保留時(shí)間試驗(yàn)

取標(biāo)2和樣品各一份，分別按100μl進(jìn)樣，按2.1色譜條件進(jìn)行分析，結(jié)果標(biāo)2的保留時(shí)間為SMZ 6.848 6 min、TMP 5.408 6min，樣品的保留時(shí)間為SMZ6.8453min、TMP5.4089min，其HPLC色譜圖見圖1。

圖1 對(duì)照品及樣品HPLC色譜圖

2.2 線性關(guān)系考察

分別取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μl，依次進(jìn)樣，按2.1色譜條件進(jìn)行分析，分別測(cè)其峰面積，采用外標(biāo)法，分別以SMZ和TMP峰面積Y為縱坐標(biāo)，各組份的濃度X（mg/ml）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，相關(guān)系數(shù)及線性范圍分別為SMZ：Y=+1.650 0 e+008 x+6.636 0 e+005，r=0.993 1，線性范圍為 20～100 mg/ml；TMP：Y=+5.890 2 e+008 x+2.168 5 e+006，r=0.996 6，線性范圍為4～20 mg/ml。對(duì)照品溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 精密度試驗(yàn)

取標(biāo)3對(duì)照品溶液100 μl，重復(fù)進(jìn)樣3次，按照2.1色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算含量，結(jié)果見表1。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.4 樣品含量測(cè)定

分別取3份樣品溶液進(jìn)樣，按照2.1色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品試驗(yàn)結(jié)果

測(cè)得的SMZ和TMP含量分別是復(fù)方磺胺甲惡唑片標(biāo)示量的94.81%和92.75%。

2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

在樣品中加入一定量的對(duì)照品母液，配置成3份加標(biāo)溶液，分別進(jìn)樣，按2.1色譜條件進(jìn)行分析，做加標(biāo)回收試驗(yàn)，計(jì)算回收率。結(jié)果見表3。

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果（%）

2.6 討論

2.6.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 復(fù)方磺胺甲惡唑片中SMZ、TMP的規(guī)格分別為4 mg/片、0.8 mg/片，含量相差較大，故本試驗(yàn)選擇TMP紫外吸收度較大的波長(zhǎng)（240 nm）為檢測(cè)波長(zhǎng)，以提高TMP測(cè)定的靈敏度和準(zhǔn)確性。

2.6.2 洗脫方式的選擇 本試驗(yàn)以甲醇：0.03 mol/L磷酸（含0.2%三乙胺）=80：20作為流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行等度洗脫，只出現(xiàn)一個(gè)峰，且前沿峰明顯，產(chǎn)生的原因可能是柱溫低、樣品溶劑使用不當(dāng)、柱過(guò)載等。采用梯度洗脫甲醇20%～50%2峰仍未分開，最后采用20%～60%甲醇梯度洗脫終使2峰完全分開。

2.6.3 流動(dòng)相的組成及選擇 2005年版藥典中以水：乙腈：三乙胺=799：200：1（用氫氧化鈉試液或冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.9）為流動(dòng)相，等度洗脫。為提高方法環(huán)境適用性，本試驗(yàn)考察了甲醇：水：冰醋酸：三乙胺 =225：345：0.5：0.2，作為流動(dòng)相體系，雖然SMZ和TMP可以得到分離，但保留時(shí)間不一致；而采用甲醇：0.03 mol/L磷酸（含0.2%三乙胺）=80：20作為流動(dòng)相等度洗脫，只出現(xiàn)溶劑峰，樣品未分離；最后采用甲醇20%～60%梯度洗脫，能使2峰達(dá)到基線分離、保留時(shí)間一致、分離度好、重現(xiàn)性好、結(jié)果準(zhǔn)確，可作為該片劑質(zhì)量控制的參考方法。

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