劉 健，馬敏杰，韓 彪，魏 寧

（蘭州大學(xué)第一醫(yī)院胸外科，甘肅 蘭州 730000）

乙酰肝素酶、堿性成纖維細(xì)胞因子與非小細(xì)胞肺癌血管生成及轉(zhuǎn)移的關(guān)系

劉 健，馬敏杰，韓 彪，魏 寧

（蘭州大學(xué)第一醫(yī)院胸外科，甘肅 蘭州 730000）

乙酰肝素酶；堿性成纖維細(xì)胞因子；非小細(xì)胞肺癌；腫瘤轉(zhuǎn)移

全世界每年約有131萬(wàn)人死于肺癌，我國(guó)是肺癌高發(fā)區(qū)，因肺癌死亡者僅次于胃癌，居第二位。腫瘤血管新生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是影響非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的重要因素[1]。堿性成纖維細(xì)胞因子（BFGF）是目前所知的最重要的促血管生長(zhǎng)因子，在腫瘤血管新生中起重要作用。非小細(xì)胞肺癌中普遍存在BFGF的高表達(dá)，并且和較差的預(yù)后[2]、腫瘤進(jìn)展[3]、血管新生[4]、淋巴浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[5]相關(guān)。在腫瘤血管新生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中，不斷伴隨著新蛋白的合成。這些新蛋白不但為腫瘤細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)所必需，對(duì)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖也很重要。因此，作為蛋白翻譯起始所必需的mRNA帽結(jié)合蛋白，乙酰肝素酶（HPs）與腫瘤的血管新生[6]、惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移[7]密切相關(guān)。HPs表達(dá)升高能促進(jìn)一系列血管新生相關(guān)蛋白如BFGF的翻譯，因此我們推測(cè)：非小細(xì)胞肺癌中BFGF和HPs的表達(dá)存在著相關(guān)性，并且和非小細(xì)胞肺癌的分化、分期、血管新生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移相關(guān)。筆者通過(guò)檢測(cè)131例非小細(xì)胞肺癌組織中HPs、BFGF的表達(dá)，以探討其在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用，并分析2者的相互關(guān)系，以便為非小細(xì)胞肺癌的早期診斷、有效治療及預(yù)后提供重要的科學(xué)依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 研究對(duì)象

131例組織標(biāo)本全部取自蘭州大學(xué)第一醫(yī)院胸外科2000～2008年資料完整的住院手術(shù)患者，患者均經(jīng)病理證實(shí)為非小細(xì)胞肺癌，年齡40～73歲，男94例，女37例。所有患者術(shù)前均未接受化療、放療或針對(duì)腫瘤的治療，均在全麻下行非小細(xì)胞肺癌切除術(shù)。131例非小細(xì)胞肺癌中高分化癌39例，中分化癌75例，低分化癌17例，全部病例按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）1997年分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，浸潤(rùn)深度：Ti 6例，T110例，T244例，T358例，T413例；淋巴分期：N044例，N187例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移：M0101例，M130例；臨床分型：0期1例，Ⅰ期7例，Ⅱa期13例，Ⅱb期51例，Ⅲ期44例，Ⅳ期15例。正常對(duì)照組織全部取自手術(shù)時(shí)切除的、距瘤體約10 cm、均經(jīng)病理證實(shí)為正常的肺組織。

1.2 標(biāo)本處理

所有標(biāo)本均經(jīng)100 mol/L甲醛液固定，常規(guī)石蠟包埋，制備成4 μm厚的連續(xù)切片5張，1張行蘇木精-伊紅染色，其余切片貼附于經(jīng)防脫處理的載玻片上，60℃干燥72 h后，用于不同的免疫組織化學(xué)染色。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蘇木精-伊紅染色 切片進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅染色。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色方法 本實(shí)驗(yàn)采用S-P染色法檢測(cè)HPs、BFGF和CD34在各標(biāo)本上的表達(dá)。S-P試劑盒，購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。將切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)標(biāo)記，3%雙氧水室溫浸泡5 min，蒸餾水洗，PBS浸泡5 min。5%～10%正常羊血清，室溫孵育10 min，傾去血清后加入適當(dāng)稀釋的一抗HPs（鼠單抗，554R16，ABCAM）、BFGF（兔單抗，Santacruz）或 CD34（MAB-0034），37℃孵育 60 min，PBS浸泡 5 min，共 3次。滴加生物素標(biāo)記的二抗37℃孵育15 min，PBS浸泡5 min，共3次。滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素37℃孵育15 min，PBS浸泡3 min，共3次。DAB顯色，水洗后，蘇木精復(fù)染，分色，返藍(lán)，脫水，透明封固。以PBS代替第一抗體為陰性對(duì)照。

1.3.3 觀察指標(biāo)（1）HPs陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：HPs、選染色均勻的區(qū)域，顯微鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性，≥10%為陽(yáng)性。切片中癌組織陽(yáng)性染色弱，陽(yáng)性范圍＜50%癌組織面積者判定為（＋）；染色弱，陽(yáng)性范圍＞50%判定為（＋＋）；染色強(qiáng)，陽(yáng)性范圍＜ 50%判定為（＋＋＋）；染色強(qiáng)，陽(yáng)性范圍＞50%判定為（＋＋＋＋）。并將染色強(qiáng)度（+）～（＋＋）劃分為低表達(dá)，（＋＋＋）～（＋＋＋＋）劃分為高表達(dá)[8]。

（2）BFGF陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)BFGF標(biāo)記切片，采用 Eastham等[9]的方法。即切片中癌組織陽(yáng)性染色弱，陽(yáng)性范圍＜癌組織面積 50%者判定為（＋）；染色弱，陽(yáng)性范圍＞50%判定為（＋＋）；染色強(qiáng)，陽(yáng)性范圍＜50%判正為（＋＋＋）；染色強(qiáng)，陽(yáng)性范圍＞50%判定為（＋＋＋＋）。并將染色強(qiáng)度（+）～（＋＋）劃分為低表達(dá)，（＋＋＋）～（＋＋＋＋）劃分為高表達(dá)[8]。以腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。

（3）CD34陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：在低倍視野下選取腫瘤微血管數(shù)量（CD34陽(yáng)性）最豐富區(qū)域，在200倍視野范圍計(jì) 5個(gè)視野的微血管數(shù)目，取平均值作為腫瘤微血管密度（MVD）；以血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0分析資料，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)、方差分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，應(yīng)用Log-Rank檢驗(yàn)比較不同組別患者的生存時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 非小細(xì)胞肺癌及正常肺組織中HPs、BFGF、MVD的表達(dá)

131例非小細(xì)胞肺癌組織中，HPs陽(yáng)性105例（80.2%），BFGF陽(yáng)性99例（75.6%）。20例正常肺組織中未見HPs陽(yáng)性表達(dá)，6例BFGF陽(yáng)性表達(dá)。非小細(xì)胞肺癌組織中HPs和BFGF的表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于正常肺組織（P<0.01）。非小細(xì)胞肺癌中MVD計(jì)數(shù)為（30.59±13.38）個(gè)，顯著高于正常肺組織的MVD計(jì)數(shù)（13.82±4.16）個(gè)（見表 1）。

表1 HPs、BFGF和MVD在非小細(xì)胞肺癌和正常肺組織中的表達(dá)

2.2 HPs、BFGF和MVD的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌分化程度的關(guān)系（見表2）

HPs在高、中、低分化非小細(xì)胞肺癌中陽(yáng)性率分別為：66.7%、84.0%、94.1%（P＜0.05）；BFGF 在高、中、低分化非小細(xì)胞肺癌中陽(yáng)性率分別為：74.4%、78.7%、64.7%（P＞0.05）；MVD 在高、中、低分化非小細(xì)胞肺癌中分別為：33.13±7.93、31.92±5.29、32.52±6.17（P＞0.05）。本研究提示HPs基因過(guò)度表達(dá)隨惡性度增加而升高，從而證實(shí)HPs有使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的能力。而BFGF、MVD在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌分化程度無(wú)關(guān)。

2.3 HPs、BFGF和MVD的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床分期的關(guān)系（見表2）

HPs在0+Ⅰ+Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期中陽(yáng)性率分別為：73.6%、88.1%（P＜0.05）。BFGF在0+Ⅰ+Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期中陽(yáng)性率分別為：68.1%、84.7%（P＜0.05）。MVD在0+Ⅰ+Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期中分別為：35.95±5.19、43.19±7.15（P>0.05）。由此說(shuō)明，HPs、BFGF 在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)與臨床分期顯著相關(guān)（P＜0.05），非小細(xì)胞肺癌組織中MVD與臨床分期無(wú)相關(guān)性（P>0.05）。

2.4 HPs、BFGF和MVD的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移M分期的關(guān)系（見表2）

表2顯示，HPs、BFGF在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移M分期情況呈顯著相關(guān)性，非小細(xì)胞肺癌組織中MVD與非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無(wú)顯著相關(guān)性。

2.5 HPs 與BFGF在非小細(xì)胞肺癌中的關(guān)系

HPs在本組非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)與BFGF的表達(dá)有顯著性差異（r=0.553，P=0.000），同時(shí)，HPs與 BFGF 在本組非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)與MVD有顯著性差異（P=0.000）。

2.6 不同HPs表達(dá)水平對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者生存時(shí)間的影響（見表 3、圖 1）

根據(jù)HPs的表達(dá)水平將131例患者分成3組，采用Ka－Plan-meier方法描繪3組的生存曲線，用Log-Rank檢驗(yàn)比較3組生存時(shí)間，3組之間有極顯著性差異（P＜0.001）。

表2 HPs、BFGF和MVD在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)

表3 Log-Rank檢驗(yàn)比較3組生存時(shí)間

圖1 不同HPs表達(dá)水平的非小細(xì)胞肺癌患者生存曲線

2.7采用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型預(yù)測(cè)影響非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的因素（見表 4）

表4 影響非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的因素分析

采用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型，擬對(duì)131例非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理因素及癌組織中HPs、BFGF、MVD的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行預(yù)后多因素分析。由表4可知HPs的表達(dá)程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是非小細(xì)胞肺癌術(shù)后影響患者生存時(shí)間的危害性因素。

3 討論

人類乙酰肝素酶基因位于第4條染色體上，有12個(gè)外顯子，11個(gè)內(nèi)含子，編碼區(qū)總跨度為39 113個(gè)核苷酸，編碼區(qū)上游2.3 kb區(qū)包含一啟動(dòng)子。結(jié)構(gòu)完整的人類乙酰肝素酶CDNA是一個(gè)由543個(gè)氨基酸殘基切除后，形成一個(gè)同上C端386個(gè)氨基酸殘基組成的活性很強(qiáng)的成熟蛋白，分子量約為50 kDa；并且這種前體酶的水解激活是所有參與ECM蛋白降解及細(xì)胞浸潤(rùn)酶類的共同特征。同一種族的不同組織細(xì)胞間，如人的胎盤、血小板、轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞等也表達(dá)同一種乙酰肝素酶。癌癥的轉(zhuǎn)移是癌細(xì)胞從癌組織中突破胞外基質(zhì)的限制，轉(zhuǎn)移擴(kuò)散到別的器官并繼續(xù)增殖所造成的。癌癥成為致命的疾病，不僅在于癌細(xì)胞的生長(zhǎng)失去控制，更在于其轉(zhuǎn)移能力。在轉(zhuǎn)移過(guò)程中，細(xì)胞粘附、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、ECM的降解及血管生成是腫瘤轉(zhuǎn)移的決定性因素，在本研究中乙酰肝素酶及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.001）。同時(shí)，與微血管密度在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)密切相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)資料表明乙酰肝素酶及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)。

非小細(xì)胞肺癌中普遍存在BFGF的高表達(dá)，并且和較差的預(yù)后[2]、腫瘤進(jìn)展[3]、血管新生[4]、淋巴浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[5]相關(guān)。這些高表達(dá)的BFGF是否由EIF4e所驅(qū)動(dòng)，對(duì)于研究非小細(xì)胞肺癌血管新生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的詳細(xì)機(jī)制，進(jìn)而提供新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。本研究通過(guò)在131例不同分化非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本中對(duì)HPs、BFGF的表達(dá)水平檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)HPs和BFGF蛋白在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于正常肺組織。高表達(dá)的HPs和BFGF與非小細(xì)胞肺癌中腫瘤浸潤(rùn)、淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和較高的臨床分期呈正相關(guān)。我們還檢測(cè)了HPs與BFGF在非小細(xì)胞肺癌中不同區(qū)域的表達(dá)，分析2者之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，2者之間的相關(guān)系數(shù)為0.533，提示2者之間密切相關(guān)，且成正相關(guān)，即HPs的高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致BFGF的表達(dá)水平增高。這說(shuō)明在非小細(xì)胞肺癌中，HPs的表達(dá)和BFGF具有相似的趨勢(shì)，2者可能存在某些調(diào)節(jié)關(guān)系。

在許多腫瘤中，HPs和BFGF的表達(dá)具有高度相關(guān)性。Yang SX等[10]應(yīng)用組織芯片分析了多種腫瘤來(lái)源的組織，發(fā)現(xiàn)HPs和BFGF在黑色素瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌、淋巴瘤、前列腺癌和卵巢癌等中都具有相關(guān)性[10]。BFGF在非小細(xì)胞肺癌中是一個(gè)重要的預(yù)后因子，而HPs的研究相對(duì)較少。Salehi等[11]發(fā)現(xiàn)HPs在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)顯著高于正常肺組織，并且與進(jìn)展期非小細(xì)胞肺癌密切相關(guān)。我們的研究證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)，同時(shí)還首次發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌中HPs和BFGF的表達(dá)具有高度相關(guān)性。

HPs和BFGF高度相關(guān)，而BFGF能促進(jìn)血管新生、導(dǎo)致腫瘤微血管密度增加。我們接著比較了HPs表達(dá)和MVD的表達(dá)趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)在浸潤(rùn)深度、淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床分期方面，2者的表達(dá)趨勢(shì)高度一致。這說(shuō)明HPs表達(dá)能促進(jìn)血管新生、增加腫瘤微血管密度，這很可能是通過(guò)增加BFGF表達(dá)介導(dǎo)的。

我們還發(fā)現(xiàn)，HPs基因蛋白在高分化、中分化、低分化的表達(dá)率是遞增的（66.7%、84.0%、94.1%），提示HPs基因過(guò)度表達(dá)隨腫瘤惡性程度增加而升高，從而證實(shí)HPs有使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的能力。而BFGF和MVD在不同分化狀態(tài)的非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本中的表達(dá)無(wú)顯著性差異。這表明HPs在不同分化程度非小細(xì)胞肺癌的差異表達(dá)和腫瘤細(xì)胞增殖、致瘤性等特征相關(guān)，這可能與促進(jìn)生長(zhǎng)因子的蛋白翻譯有關(guān)。我們的研究也證實(shí)了其他作者在非小細(xì)胞肺癌中的發(fā)現(xiàn)：HPs高表達(dá)于低分化非小細(xì)胞肺癌組織[12]。

我們分析了非小細(xì)胞肺癌患者的生存時(shí)間，發(fā)現(xiàn)HPs表達(dá)水平與生存時(shí)間顯著相關(guān)，HPs表達(dá)越高，生存時(shí)間越短。多因素分析顯示：HPs的表達(dá)程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是非小細(xì)胞肺癌術(shù)后影響生存時(shí)間的危害性因素。而BFGF和MVD對(duì)生存影響相對(duì)較小。

我們的研究不僅揭示非小細(xì)胞肺癌高表達(dá)BFGF和HPs存在相關(guān)，還證實(shí)HPs是一個(gè)比BFGF更好的、用于預(yù)測(cè)患者生存的預(yù)后因子。這將為研究非小細(xì)胞肺癌新的治療方法提供重要信息，針對(duì)HPs的反義核酸在動(dòng)物體內(nèi)可以有效抑制腫瘤生長(zhǎng)且毒性很小[13]。因而，非小細(xì)胞肺癌中，靶向HPs的治療值得進(jìn)一步研究。

我們的研究表明：HPs、BFGF協(xié)同表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌血管生成、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移起到關(guān)鍵性的作用。HPs的過(guò)度表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的致瘤性和生存時(shí)間密切相關(guān)，且能作為非小細(xì)胞肺癌惡性程度的一個(gè)分子標(biāo)志和治療靶標(biāo)。

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G424.31

B

1671-1246（2011）08-0091-04

本文系甘肅省科學(xué)事業(yè)項(xiàng)目“乙酰肝素酶、堿性成纖維細(xì)胞因子在肺癌中的表達(dá)及臨床意義”（QS061-C33-13）的研究成果