張海松，張永明，王 艷,張 倩，*，周 政

（1.杭州萬向職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)系，浙江杭州 310023；

2.中糧肉食（宿遷）有限公司研發(fā)部，江蘇宿遷 223800；

3.貴州大學(xué)生命科學(xué)院食品系，貴州貴陽 550025）

雞肉多肽酶解條件的研究

張海松1，張永明2，王 艷3,張 倩1，*，周 政3

（1.杭州萬向職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)系，浙江杭州 310023；

2.中糧肉食（宿遷）有限公司研發(fā)部，江蘇宿遷 223800；

3.貴州大學(xué)生命科學(xué)院食品系，貴州貴陽 550025）

探索雞肉多肽酶解的最佳條件。以雞肉、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶為原料，酶解液中多肽濃度和最終多肽得率為指標(biāo)，采用單因素和正交實(shí)驗(yàn)篩選雞肉多肽酶解的最佳條件。結(jié)果：木瓜蛋白酶用量2.50%（[E]/[S]，W/W），底物濃度9%（[S]），pH7.70，水解溫度60℃，水解時(shí)間4h，多肽得率為58.22%。結(jié)論：木瓜蛋白酶能有效水解雞肉獲得雞肉多肽,其酶解雞肉多肽的得率比胰蛋白酶高。

雞肉，多肽，木瓜蛋白酶，胰蛋白酶

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，酶工程在食品中應(yīng)用越來越廣泛，利用酶技術(shù)處理植物蛋白如大豆蛋白質(zhì)、玉米蛋白質(zhì)等，從而提高大豆、玉米等資源的利用率，進(jìn)一步推動(dòng)植物蛋白的深加工和提升產(chǎn)品的附加值[1]。近年來，對(duì)大豆多肽酶解條件、工藝、制備方法以及大豆肽的提取、分離以及生物活性等研究成為熱點(diǎn)[2]，此外，在海產(chǎn)品蛋白酶水解多肽方面也引起研究者們的關(guān)注[3]，然而對(duì)雞肉酶水解的研究則主要集中在雞肉蛋白質(zhì)水解成為氨基酸工藝條件的探索方面，謝永洪等確定了木瓜蛋白酶對(duì)雞肉進(jìn)行水解的最優(yōu)條件[4]。曹東旭等的研究表明，雞肉單酶水解較優(yōu)的酶是胰蛋白酶和木瓜蛋白酶；雙酶水解中，胰蛋白酶與酸性蛋白酶在各自最適條件下組合水解率最高，進(jìn)一步確定了雙酶水解的條件[5]。鑒于多肽具有多種生物活性，因此，本研究探明雞肉多肽酶解的最佳條件，為提高雞肉的資源利用率和附加值提供新的途徑，在保健食品和藥品開發(fā)方面提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞胸肉 市售新鮮雞胸肉；木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸、三氯乙酸、酪蛋白、硫酸銅、Tris-HCl緩沖液（pH=8.2）、鄰苯三酚、硫酸亞鐵等試劑 均為國產(chǎn)分析純。

HH.S11-4型電熱恒溫水浴鍋 北京長安科學(xué)儀器廠；LD4-2低速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；722光柵分光光度計(jì) 上海分析儀器總廠；D.D.S-300型組織搗碎機(jī) 長沙市西區(qū)紅星電器廠；磁力攪拌器 金壇市大地自動(dòng)化儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雞肉粉的制備 將新鮮雞胸肉剔除脂肪和肌腱，切片，用蒸鍋蒸熟后置于80℃烘箱中干燥7～8h，取出粉碎，過100目篩，放入密閉容器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 酶水解的工藝流程 雞肉粉→加水調(diào)底物濃度→加入蛋白酶→混合均勻（調(diào)pH、保溫）→酶解→離心去沉淀→去掉蛋白質(zhì)→測定多肽含量

操作要點(diǎn)：按一定的底物濃度準(zhǔn)確稱取雞肉粉于錐形瓶中，加入適量蒸餾水，輕微攪拌至底物均勻溶解于水中。然后在90℃下加熱10min，冷卻到酶解反應(yīng)溫度后，用0.5mol/L的NaOH和1.0mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)酸堿度至所需的pH，依據(jù)所用酶的濃度，準(zhǔn)確稱取蛋白酶后加入錐形瓶中，振蕩均勻，置于預(yù)定溫度的水浴鍋中恒溫反應(yīng)一定時(shí)間。反應(yīng)到預(yù)定時(shí)間，即停止加熱振蕩，迅速升溫到85℃，加熱10m in鈍化蛋白酶[6]。

1.2.3 多肽含量與得率的測定 多肽含量以總蛋白含量減去可溶性蛋白含量，將等體積10%的三氯乙酸（TCA）加入到雞肉酶解液中，靜置0.5h后以4000r/min離心10m in，去除可溶性蛋白和長鏈肽沉淀。用雙縮脲法測定上清液中多肽含量[7]。雞肉多肽得率（%）=[（多肽含量（g）/雞肉粉重量（g）]×100%

1.2.4 酶解條件單因素篩選 分別對(duì)影響酶活性的條件進(jìn)行單因素篩選，如酶濃度、pH、溫度、底物濃度、水解時(shí)間。

1.2.5 雙酶聯(lián)合酶解正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 因素水平見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 雞肉最適酶解條件的確定

2.1.1 酶最適用量的篩選 從圖1中可以看出，隨著酶用量的增加，蛋白質(zhì)被水解，酶解液中的多肽濃度逐漸增大，木瓜蛋白酶在酶用量為2.50%時(shí)水解液中的多肽濃度達(dá)到最大，胰蛋白酶在酶用量為2.00%時(shí)水解液中的多肽濃度達(dá)到最大，隨著酶用量的增加其多肽的濃度反而降低，說明有部分多肽被進(jìn)一步水解為氨基酸。因此確定木瓜蛋白酶水解雞肉的最佳酶用量為2.50%，胰蛋白酶水解雞肉的最適酶用量為2.00%。

圖1 酶用量對(duì)酶解雞肉多肽的影響

2.1.2 酶最適pH的篩選 從圖2中可以看出，隨著pH的增加，溶液中的多肽濃度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，其中兩種酶在pH 7.70時(shí)，水解液中的多肽濃度最大，到8.70時(shí)又有所下降，說明pH 7.70為兩種酶的最適pH。

圖2 pH對(duì)酶解雞肉多肽的影響

2.1.3 酶最適底物濃度的篩選 圖3顯示，隨著底物濃度的增大，溶液中多肽濃度也在增大，木瓜蛋白酶的底物濃度在9%時(shí)水解液中的多肽濃度達(dá)到最大，在11%時(shí)多肽濃度反而有所下降，而胰蛋白酶的底物濃度在9%和11%時(shí)水解液中的多肽濃度達(dá)到最大，因此，確定兩種酶水解雞肉的最適底物濃度為9%。

圖3 底物濃度對(duì)酶解雞肉多肽的影響

2.1.4 酶最適水解溫度的篩選 圖4表明，隨著水解溫度的上升，溶液中的多肽濃度隨之增加，說明適當(dāng)?shù)臏囟扔欣诿附獾倪M(jìn)行。當(dāng)水解溫度達(dá)到60℃時(shí)，兩種酶的水解液中的多肽濃度達(dá)到最大，溫度到65℃時(shí)，多肽濃度反而下降，溫度過低或過高時(shí)，其酶的活性都受到抑制，不利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行，溫度過高可以引起蛋白質(zhì)變性，說明60℃是兩種酶的最適溫度，因此，確定兩種酶水解雞肉的最適水解溫度為60℃。

圖4 水解溫度對(duì)酶解雞肉多肽的影響

2.1.5 酶最適水解時(shí)間的篩選 圖5表明，隨著水解時(shí)間的延長，溶液中多肽濃度先增加后減少。木瓜蛋白酶在水解4h時(shí)水解液中的多肽濃度最大，胰蛋白酶在水解5h時(shí)水解液中的多肽濃度達(dá)到最大，說明在最大濃度之前，雞肉蛋白質(zhì)的酶解不夠充分，蛋白質(zhì)沒有完全水解，所以多肽濃度不高。在水解達(dá)到最大濃度之后，由于水解時(shí)間過長，部分多肽被水解為氨基酸等物質(zhì)。因此確定木瓜蛋白酶水解雞肉的最適水解時(shí)間為4h，胰蛋白酶水解雞肉的最適水解時(shí)間為5h。

圖5 水解時(shí)間對(duì)酶解雞肉多肽的影響

2.2 雙酶酶解效果

表2 雙酶水解雞肉多肽條件篩選

表2結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組8的水解液中多肽濃度達(dá)到最大，為10.88mg/m L，最佳組合為A3B2C1D3?？紤]到底物最優(yōu)利用及底物的影響最小，最優(yōu)組合為A1B2C1D3，即底物濃度9%，pH為7.70，溫度55℃，酶用量為2.50%（木瓜蛋白酶∶胰蛋白酶=7∶3）。根據(jù)極差R值的大小，可以判斷各因素對(duì)酶解雞肉的影響程度為：酶用量＞pH＞溫度＞底物濃度。

2.3 三種酶解條件的優(yōu)化

從表3中可以看出，單獨(dú)使用木瓜蛋白酶水解的多肽濃度高于其他兩種酶解方式，因此實(shí)驗(yàn)確定用木瓜蛋白酶進(jìn)行水解。

表3 三種酶解方式對(duì)雞肉多肽的影響

3 結(jié)論

3.1 兩種酶雞肉多肽的最適水解條件

實(shí)驗(yàn)分析得到木瓜蛋白酶的最適水解條件為：酶用量2.50%，pH 7.70，底物濃度為9%，水解溫度為60℃，水解時(shí)間為4h。胰蛋白酶的最適水解條件為：酶用量2.0%，pH 7.70，底物濃度為9%，水解溫度為60℃，水解時(shí)間為5h。

3.2酶制劑的最適選擇

通過兩種酶制劑單獨(dú)和組合實(shí)驗(yàn)，其水解能力的測定結(jié)果，在實(shí)驗(yàn)選擇的條件下，發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶的效果最理想。兩種酶制劑協(xié)同作用需要進(jìn)一步深入研究。

3.3 酶解雞肉制備多肽的最適條件

通過本實(shí)驗(yàn)，證明酶解雞肉制備多肽確實(shí)可行，并獲得酶解雞肉多肽的最佳條件為：以木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，酶用量為2.50%，底物濃度為9%，pH為7.70，水解溫度為60℃，水解時(shí)間為4h，此時(shí)的多肽得率可達(dá)到58.22%。

[1]郭軍，張學(xué)忠.低分子量玉米肽的制備分離純化及其生理活性的研究[D].長春：吉林大學(xué)，2007（5）:1－69.

[2]郭紅蓮.大豆蛋白生物降解及大豆肽的研究進(jìn)展[J].糧油加工與食品機(jī)械，2005（4）:50－52.

[3]蘇捷.海產(chǎn)品蛋白酶水解多肽研究進(jìn)展[J].漁業(yè)現(xiàn)代化，2008，35（2）:53－56.

[4]謝永洪，劉學(xué)文，王文賢，等.雞肉蛋白酶水解工藝條件的研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2004，20（5）:207－210.

[5]曹東旭，姚秀玲，陳惠娟，等.雞肉蛋白水解液的研究[J].天津輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，42（3）:11－13.

[6]魯偉，任國譜，宋俊梅.蛋白水解液中多肽含量的測定方法[J].食品科學(xué)，2005，26（7）:169－171.

[7]蔡武成，袁厚積.生物物質(zhì)常用化學(xué)分析法[M].北京:科學(xué)出版社，1982:95－96.

Study on enzymatic hydrolysis conditions of chicken meat polypeptides

ZHANG Hai-song1,ZHANG Yong-ming2,WANG Yan3,ZHANG Qian1,*,ZHOU Zheng3
（1.Development of Biological Technology,Hangzhou Wanxiang Polytech,Hangzhou 310023，China；
2.R&D Cofco Meat(SU QIAN)Co.,LTD.,Suqian 223800，China；
3.Development of Food Science in College of Life Science,Guizhou University,Guiyang 550025，China）

The optimum conditions of enzymatic hydrolysis were investigated for chicken meat. Yield of polypeptides from chicken meat hydrolysised by papain and trypsin were determined by the concentration and yield rate of polypeptides. The optimization condition of producing polypeptides through enzymatic hydrolysis was selected using the orthogonal experiment. It was observed the optimal condition of enzymatic hydrolysis for chicken meat polypeptides was obtained when using 2.50% papain ([E]/[S]，W/W)，substrates concentration at 9% ([S])，pH 7.70，and hydrolysis time 4h，at which the yield of polypeptide was 58.22%. Based on the results from the current study，it was concluded that papain was effective on yielding polypeptides from chicken meat hydrolyzed，suggesting the yield rate of this enzyme higher that of trypsin. Thus，it was expected to lay the basis for studying the bioactivity of chicken meat polypeptides.

chicken meat；polypep tides；papain；trypsin

TS201.2+5

B

1002-0306（2011）10-0325-03

2011－07－25 * 通訊聯(lián)系人

張海松（1957-），男，副教授，學(xué)士。

教育部留學(xué)回國科研基金（教外司留2008890號(hào)）。