北京市海淀區(qū)藥品檢驗(yàn)所（100083）楊帆

本研究參照《中國(guó)藥典》2005年版第二部中“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”試驗(yàn)的基本原理和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查干擾/確證試驗(yàn)的設(shè)計(jì)[1][2]，建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 盲樣凍干粉（70-A；70-B；70-C）。細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品批號(hào)：150601-200862，規(guī)格：120 EU/ml，由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。鱟試劑批號(hào)：0904230，裝量：0.1ml/支，靈敏度：0.25EU/ml，由湛江博康海洋生物有限公司提供。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水）批號(hào)：090511，裝量：2ml/支，由湛江博康海洋生物有限公司提供。ZH-Z型自動(dòng)旋渦混合器，由天津市天大天發(fā)科技有限公司提供。HHSIINII型電熱恒溫水浴箱，由上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠提供。

1.2 細(xì)菌內(nèi)毒素理論限值（L）的計(jì)算 樣品在實(shí)驗(yàn)前需用1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶，3份樣品根據(jù)能力驗(yàn)證計(jì)劃作業(yè)指導(dǎo)書(shū)設(shè)定的細(xì)菌內(nèi)毒素限值均為“應(yīng)小于50EU/ml。

1.3 鱟試劑靈敏度（λ）復(fù)核試驗(yàn) 按照《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄ⅪE細(xì)菌內(nèi)毒素靈敏度復(fù)核項(xiàng)下進(jìn)行試驗(yàn)[1]，結(jié)果所用鱟試劑靈敏度均在0.5～2.0λ范圍內(nèi)，符合規(guī)定，可用于本試驗(yàn)。

1.4 干擾試驗(yàn) 最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的計(jì)算。盲樣樣品的內(nèi)毒素限度值設(shè)定L＝50EU/ml，且濃度為1ml/ml，對(duì)應(yīng)于靈敏度λ=0.25 EU/ml的鱟試劑，注射用環(huán)磷腺苷內(nèi)毒素檢測(cè)最低有效稀釋倍數(shù)為MVD=c×L/λ=200。

1.5 供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查試驗(yàn) 根據(jù)干擾試驗(yàn)結(jié)果，選擇200倍稀釋后的供試品液試驗(yàn)。然后用λ=0.25EU/ml的鱟試劑試驗(yàn)，并設(shè)供試品陽(yáng)性對(duì)照（2λ）、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照（2λ）。再取λ=0.25EU/ml的鱟試劑16支，分別用0.1 ml BET水溶解，再加入配制好的供試品稀釋液0.1ml，每種藥液平行做2管，37℃保溫，60min后觀察結(jié)果。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度（λ）復(fù)核試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)核靈敏度λc=λ，鱟試劑靈敏度標(biāo)示符合規(guī)定。見(jiàn)附表1。

附表1 鱟試劑標(biāo)示靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

2.2 干擾試驗(yàn)結(jié)果 各濃度對(duì)鱟試劑均無(wú)干擾，因其理論稀釋倍數(shù)為200倍，所以確定供試品濃度0.25EU/ml為最終有效稀釋濃度。見(jiàn)附表2。MVD=c×L/λ=1×50/0.25=200（倍）。

2.3 確證試驗(yàn)結(jié)果 當(dāng)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的Es值在0.5～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）時(shí)，而供試品的Et值在0.5～2.0Es（包括0.5Es和2.0Es）時(shí)，即無(wú)干擾作用。反之，則有。供試品的濃度在0.25EU/ml時(shí)，對(duì)以上3個(gè)樣品的鱟試劑均未產(chǎn)生干擾作用。結(jié)果見(jiàn)附表2。

2.4 供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查試驗(yàn) 本試驗(yàn)條件下，按細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則進(jìn)行試驗(yàn)，可以用稀釋方法排除干擾；對(duì)供試品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行檢測(cè)。

2.5 供試品檢查

2.5.1 溫度控制 實(shí)驗(yàn)前接通恒溫儀電源，溫度調(diào)至（37+1）℃。

2.5.2 細(xì)菌內(nèi)毒素溶液制備

2.5.3 供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液的制備 分別取0.5ml 2倍濃度的供試品+0.5ml 4λ的內(nèi)毒素制成混合均勻的供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液，備用。

2.5.4 鱟試劑的準(zhǔn)備 取鱟試劑16支，0.1ml/支，按標(biāo)示量加入BET用水復(fù)溶，備用。

2.5.6 試驗(yàn)加樣 結(jié)果見(jiàn)附表3。

2.5.7 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果 見(jiàn)附表4。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，盲樣70-B、70-C的細(xì)菌內(nèi)毒素含量小于理論限值50EU/ml，70-A的細(xì)菌內(nèi)毒素含量大于理論限值50EU/ml。

附表2 鱟試劑標(biāo)示靈敏度復(fù)核試驗(yàn)結(jié)果

附表3 試驗(yàn)加樣表（ml）

附表4 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

4 討論

4.1 由于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重現(xiàn)性好，快速、方便，一次可檢查多批檢品，使用性強(qiáng)，故用本方法來(lái)檢查細(xì)菌內(nèi)毒素含量，達(dá)到安全用藥的目的。

4.2 本文先通過(guò)干擾試驗(yàn)確定供試品的有效稀釋濃度，再由確證試驗(yàn)進(jìn)一步修整，以減少干擾試驗(yàn)的盲目性，避免浪費(fèi)試劑，節(jié)省時(shí)間。鱟試劑要求的pH值范圍和其他因素可以通過(guò)稀釋來(lái)排除干擾[3][4]。

4.3 假陽(yáng)性或高陽(yáng)性的原因：①所用試管、針頭、注射器未完全消除熱原。②溶解鱟試劑時(shí)，用力太大，產(chǎn)生較多泡沫，產(chǎn)生假陽(yáng)性。③操作環(huán)境污染。④鱟試劑的靈敏度不符合規(guī)定，易呈現(xiàn)高陽(yáng)性。⑤由于凝聚反應(yīng)是不可逆的，所以在恒溫反應(yīng)過(guò)程及觀察結(jié)果時(shí)，應(yīng)注意不要使試管受到振動(dòng)，以免使凝膠破碎產(chǎn)生假陰性。⑥每次稀釋倍數(shù)不得超過(guò)10倍。