范偉偉, 王亞斌, 張榮慶, 李聰葉, 李 霜, 曹 豐

第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心血管內(nèi)科，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院分子影像研究中心，西安 710032

分子影像監(jiān)測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子預(yù)處理促進(jìn)體外和體內(nèi)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞存活與增殖的研究

范偉偉, 王亞斌, 張榮慶, 李聰葉, 李 霜, 曹 豐

第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心血管內(nèi)科，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院分子影像研究中心，西安 710032

干細(xì)胞療法為缺血性心血管病的組織再生帶來(lái)希望，然而體內(nèi)移植后干細(xì)胞的不良轉(zhuǎn)歸嚴(yán)重制約了其治療效果。研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）或可對(duì)干細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用；同時(shí)，分子影像可作為干細(xì)胞研究的有力手段，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)外干細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程的可視化與實(shí)時(shí)定量監(jiān)測(cè)。該研究首先培養(yǎng)了穩(wěn)定表達(dá)螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，然后運(yùn)用報(bào)告基因光學(xué)成像等分子影像學(xué)方法，對(duì)體外及體內(nèi)移植后脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的存活與增殖進(jìn)行示蹤和定量分析，并觀察VEGF預(yù)處理對(duì)細(xì)胞活性的影響。光學(xué)成像和定量分析結(jié)果提示，VEGF可以顯著改善體外缺氧損傷后脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的生存與增殖，并延長(zhǎng)其體內(nèi)移植后的生存時(shí)間。由此證實(shí)，分子影像可以對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的體外與體內(nèi)生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行無(wú)創(chuàng)、直觀、高通量監(jiān)測(cè)，并能有效評(píng)價(jià)保護(hù)性因子VEGF對(duì)細(xì)胞的作用。

分子影像；間充質(zhì)干細(xì)胞；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子

引 言

根據(jù)世界衛(wèi)生組織 (WHO)2008年的預(yù)測(cè)，在未來(lái)20年內(nèi)，缺血性心臟病的死亡率仍將高居全球各類(lèi)疾病的首位[1]。由于心肌細(xì)胞為不可再生的終末分化細(xì)胞，因此常規(guī)的手術(shù)及藥物等治療方法仍不能從根本上逆轉(zhuǎn)缺血導(dǎo)致的心肌組織損傷和進(jìn)行性功能減退。近年來(lái)，干細(xì)胞因具有自我更新和多向分化等特性，為缺血性心臟病的再生治療帶來(lái)了新的希望[2,3]。研究顯示，將胚胎干細(xì)胞[4](embryonic stem cells，ESCs)或成體干細(xì)胞[5](adult stem cells，ASCs)移植入梗死心肌可改善心室重構(gòu)和心臟功能，然而其移植后的轉(zhuǎn)歸、確切療效和作用機(jī)制仍待進(jìn)一步闡明[4,5]。我們前期的研究顯示，與ESCs相比，ASCs，尤其是間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymal stem cells，MSCs)，心肌內(nèi)移植后的存活數(shù)量較少，難以發(fā)揮長(zhǎng)時(shí)程治療作用[2,6,7]。因此，尋找MSCs體外及在體準(zhǔn)確、無(wú)創(chuàng)、高效和長(zhǎng)程的監(jiān)測(cè)手段，同時(shí)探索有益于MSCs在缺血組織部位的存活、整合、增殖或分化的有利因素，是進(jìn)一步研究和促進(jìn)MSCs有效治療作用的關(guān)鍵。

新興的分子影像學(xué) (molecular imaging)可以實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞生物學(xué)狀態(tài)和過(guò)程的實(shí)時(shí)、直觀、動(dòng)態(tài)、定量、可重復(fù)及特異性成像[8]，為干細(xì)胞的生物學(xué)研究提供了有力平臺(tái)。此外，研究證實(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性有絲分裂原，能促進(jìn)血管新生和心功能的恢復(fù)[9]，并可能對(duì)干細(xì)胞具有保護(hù)作用[10]。在之前的研究中，我們運(yùn)用分子影像方法已證實(shí)VEGF可以改善移植胚胎干細(xì)胞的存活與增殖[10]。

因此，以前期的分子影像研究為基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)采用生物自發(fā)光成像 (bioluminescence imaging）等多種評(píng)價(jià)方法，對(duì)穩(wěn)定表達(dá)螢火蟲(chóng)熒光素酶 (firefly luciferase，fluc)報(bào)告基因的脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞 (adipose-derived MSCs，ADMSCs)進(jìn)行監(jiān)測(cè)與示蹤，以實(shí)時(shí)、定量地評(píng)價(jià)體外缺氧/復(fù)氧 (hypoxia/reoxygenation，H/R)損傷及體內(nèi)移植后，VEGF預(yù)處理對(duì)MSCs的生物學(xué)活性所產(chǎn)生的影響，旨在為MSCs療效評(píng)估提供無(wú)創(chuàng)影像學(xué)手段。

材料和方法

材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為：1)SPF級(jí)β-actin-luc轉(zhuǎn)基因FVB/N小鼠20只 (8～10周齡)，購(gòu)自美國(guó)Caliper公司；2)8周齡的雄性BALB/c裸鼠20只 (體質(zhì)量20～25 g)，購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，以上動(dòng)物均飼養(yǎng)于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》。DMEM/F12培養(yǎng)基及胎牛血清 (fetal bovine serum，F(xiàn)BS)等購(gòu)自美國(guó)Thermo Hyclone公司；Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸 (EDTA)、二甲亞砜 (DMSO)、青/鏈霉素等均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；VEGF、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (basic fibroblast growth factor，bFGF)購(gòu)自美國(guó)PeprotechAsia公司；熒光兔抗鼠單克隆抗體CD44-PE、CD90-APC、CD34-PE、CD45-PE及同種型IgG購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；小動(dòng)物分子成像系統(tǒng) (Xenogen IVIS Kinetic)及LivingImage 3.2軟件購(gòu)自美國(guó)Caliper公司；D-luciferin購(gòu)自美國(guó)Biotium公司；倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司，三氣孵箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

方法

ADMSCs的分離培養(yǎng)和表型鑒定

基于Zuk等[11]提出的方法并稍作修改。β-actin-luc小鼠脫頸處死，無(wú)菌分離腹腔脂肪組織，剪碎加入0.2% Ⅰ型膠原酶，輕微振搖下在37℃水浴消化1 h。等體積含有DMEM/F12和10%FBS的完全培養(yǎng)基終止消化，細(xì)胞懸液室溫下200×g離心10 min，重懸后在細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基 (完全培養(yǎng)基中加入5 ng/mL bFGF，青/鏈霉素各100 U/mL)中，以37℃、5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)12 h，去除未貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞消化后，以2×104/cm2密度接種。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞生長(zhǎng)至占瓶底80%時(shí)，采用0.05%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化傳代。

取第3代ADMSCs，PBS重懸計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1.0×106/mL，根據(jù)既往研究[11]，分別加入熒光素標(biāo)記的兔抗鼠單克隆抗體CD44-PE、CD90-APC、CD34-PE和CD45-PE，4℃反應(yīng)30 min，設(shè)立同種型非特異性IgG為陰性對(duì)照，PBS洗滌后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

ADMSCs生物自發(fā)光強(qiáng)度檢測(cè)

收集第3代ADMSCs。取96孔板1塊，每組6個(gè)孔，分別加入0.5×104、1.0×104、2.0×104、4.0×104、6.0×104、8.0×104、10.0×104數(shù)量的細(xì)胞，設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔。然后每孔以150 ng/μL的濃度加入報(bào)告探針底物螢光素 (D-luciferin)，在IVIS中檢測(cè)生物發(fā)光情況，電荷耦合元件 (CCD)曝光時(shí)間為3 min，像素合并 (Binning)為4，光圈大小 (F/stop)為1，圖像分析采用LivingImage3.2軟件，采用fluc平均輻射度定量，單位為光子/秒·厘米2·單位角 (Photons·sec－1·cm－2·steradian－1，P/s·cm2·sr)。PBS 中加入 D-luciferin 作為空白對(duì)照。

H/R損傷模型的建立及VEGF分組處理

H/R損傷模型采用第3代ADMSCs，以2.0×104個(gè)細(xì)胞/孔密度接種于96孔板中，待貼壁后換用無(wú)血清DMEM/F12，置于氣體濃度為940 ml/L N2、50 ml/L CO2及10 ml/L O2的密閉缺氧孵箱中，于37℃持續(xù)缺氧6 h。PBS洗滌后加入ADMSCs完全培養(yǎng)基，放回氣體濃度為95%空氣及5%CO2的正常孵箱中，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)12 h，完成H/R損傷。

ADMSCs根據(jù)是否進(jìn)行VEGF干預(yù)和H/R損傷，分為正常對(duì)照組、單純VEGF干預(yù)組、單純H/R模型組和H/R模型+VEGF干預(yù)組。對(duì)照組于實(shí)驗(yàn)前換用含20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，按正常條件培養(yǎng)；H/R模型按上述方法。將培養(yǎng)至第3代的ADMSCs以每塊10個(gè)孔、每孔2×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于4塊96孔培養(yǎng)板。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿(mǎn)孔底的70%后，每孔分別以0～10 ng/mL濃度加入VEGF，預(yù)處理ADMSCs 48 h，備用。

ADMSCs的體外生物自發(fā)光成像和細(xì)胞存活率MTT法檢測(cè)

取上述2塊96孔板，1塊板繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng) (即單純VEGF干預(yù)組)，1塊板進(jìn)行H/R處理。H/R組復(fù)氧結(jié)束后，每孔以150 ng/μL的濃度加入D-luciferin，在IVIS中檢測(cè)生物發(fā)光情況，并根據(jù)VEGF濃度梯度和光學(xué)信號(hào)強(qiáng)度的關(guān)系繪制量效曲線(xiàn)，成像參數(shù)設(shè)定同上。PBS中加入D-luciferin作為空白對(duì)照。

生物自發(fā)光成像的同時(shí)另取上述2塊96孔板，同樣分別進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)和H/R處理。復(fù)氧結(jié)束后，向2塊板每孔加入四唑鹽溶液 (MTT，5 μg/μL)10 μl，37℃繼續(xù)孵育4 h。終止培養(yǎng)并吸除培養(yǎng)液后，每孔加入150 μl DMSO振蕩10 min至紫色結(jié)晶完全溶解。正常培養(yǎng)無(wú)VEGF干預(yù)的ADMSCs作為對(duì)照，選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值 (A值)。每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取平均值計(jì)算細(xì)胞存活率 (%)，即 (處理孔A值／對(duì)照孔A值)×100%。

ADMSCs裸鼠后肢肌肉內(nèi)移植和體內(nèi)生物自發(fā)光成像

收集2.0×107數(shù)量的第3代ADMSCs，等分為20份，每份 (含1.0×106個(gè)ADMSCs)均重懸于40 μl無(wú)菌PBS中，置于EP管內(nèi)。BALB/c裸鼠 (n=20)隨機(jī)分為MSCs組和MSCs+VEGF組。動(dòng)物麻醉后常規(guī)皮膚消毒，MSCs組將40 μl細(xì)胞懸液謹(jǐn)慎注入裸鼠腓腸肌內(nèi)，MSCs+VEGF組在40 μl細(xì)胞懸液中以10.0 ng/mL加入VEGF。細(xì)胞移植12 h后，裸鼠腹腔內(nèi)以150 mg/kg濃度注射D-luciferin，10 min后，在IVIS中進(jìn)行生物發(fā)光成像。從移植后0天起，采用生物發(fā)光成像連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察ADMSCs在體內(nèi)的存活與增殖情況，監(jiān)測(cè)至移植后第21天。成像參數(shù)設(shè)定同上。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以 x±s表示，應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異采用One-way ANOVA，組內(nèi)比較采用Dunnet-t檢驗(yàn)，顯著性水準(zhǔn)為α=0.05。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

ADMSCs的形態(tài)特征、表面標(biāo)志和生物自發(fā)光強(qiáng)度

原代ADMSCs在接種12 h后，倒置顯微鏡下可見(jiàn)少數(shù)集落生長(zhǎng)的貼壁細(xì)胞，24～48 h后，細(xì)胞逐漸融合成單層簇狀分布。傳代后細(xì)胞呈梭形，核居中。平均擴(kuò)增時(shí)間約為48 h。

圖1 體外ADMSCs的fluc報(bào)告基因光學(xué)成像和表面標(biāo)志 (A)生物自發(fā)光成像顯示不同數(shù)量的ADMSCs穩(wěn)定表達(dá)報(bào)告基因fluc；(B)流式細(xì)胞學(xué)分析證實(shí)，以同種型IgG作為陰性對(duì)照 (紅色)，體外培養(yǎng)的ADMSCs高表達(dá)MSCs的表面標(biāo)志CD90和CD44(綠色)；(C)定量分析顯示ADMSCs細(xì)胞數(shù)與fluc平均輻射度的直線(xiàn)相關(guān)關(guān)系Fig.1 Bioluminescence imaging and markers of ADMSCsin vitro (A)ADMSCs by diverse numbers stably carried the reporter gene by bioluminescence imaging; (B) Flow cytometry identified that ADMSCs highly expressed the CD90 and CD44(green)as the markers of MSCs,compare to negative isotype IgG control(red);(C)Quantitative analysis showed a linear correlation existed between cell number and fluc average radiance

報(bào)告基因光學(xué)成像結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的ADMSCs穩(wěn)定表達(dá)β-actin-luc(圖1A)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，所分離細(xì)胞的CD44、CD90陽(yáng)性率分別為89.7%和99.0%，而CD34、CD45陽(yáng)性率均小于3%，表明分離培養(yǎng)的ADMSCs高表達(dá)MSCs表面標(biāo)志 (圖1B)。定量分析表明，D-luciferin滴入后，即刻ADMSCs的fluc總輻射通量范圍是2.78×105至1.99×106(P/s)，CCD曝光時(shí)間為3 min；調(diào)整感興趣區(qū)域 (region of interest，ROI)面積為π×0.822cm2時(shí)，計(jì)算出0.5×104至 10.0×104細(xì)胞數(shù)的ADMSCs的 fluc平均輻射度，從1.20×105±1.22×104至 1.10×106±4.21×105(P/s·cm2·sr) 逐漸增強(qiáng)，與對(duì)照組 (1.26×104±1.10×103P/s·cm2·sr)相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＜0.01)。相關(guān)分析顯示，ADMSCs細(xì)胞數(shù)與fluc平均輻射度呈正直線(xiàn)相關(guān) (相關(guān)系數(shù)r2=0.94，方程為y=9.203x+76881)(圖1C)。

VEGF預(yù)處理對(duì)H/R損傷后ADMSCs生物發(fā)光成像的影響

生物發(fā)光成像結(jié)果顯示，在單純VEGF干預(yù)組，1.0～10.0 ng/mL濃度的VEGF對(duì)正常培養(yǎng)條件下ADMSCs的fluc生物發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＞0.05)(圖2A，B)。

圖2 生物發(fā)光成像評(píng)價(jià)VEGF對(duì)正常培養(yǎng)ADMSCs的影響 VEGF(濃度為1.0～10.0 ng/mL)對(duì)正常培養(yǎng)條件下ADMSCs生物發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度的影響Fig.2 Bioluminescence imaging of ADMSCs by VEGF pretreatment The images (A)and the chart(B)indicate that there is no effect of VEGF(1.0～10.0 ng/mL)on ADMSCs'bioluminescence signalintensity under common culture condition

H/R損傷后，無(wú)VEGF干預(yù)的ADMSCs(單純H/R模型組)，其fluc平均輻射度下降為6.18×104±4.23×103P/s·cm2·sr，與正常培養(yǎng)條件下的 ADMSCs(3.62×105±1.13×104P/s·cm2·sr)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)；對(duì)于4.0～10.0 ng/mL VEGF預(yù)處理的ADMSCs，其H/R損傷后fluc平均輻射度較單純H/R模型組增強(qiáng)，為1.44×105±1.77×104至2.01×105±1.00×104(P/s·cm2·sr)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性 (P＜0.05)；而 1.0～3.0(ng/mL)VEGF 濃度組，ADMSCs的fluc平均輻射度與單純H/R組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＞0.05)。結(jié)果表明，4.0～10.0(ng/mL)VEGF預(yù)處理可提高細(xì)胞H/R損傷后的生物發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度 (圖3A，B)。量效曲線(xiàn)分析顯示，不同的VEGF預(yù)處理濃度 (1.0～10.0 ng/mL)，與H/R損傷后ADMSCs的光學(xué)信號(hào)強(qiáng)度成一定的正相關(guān)關(guān)系，其效應(yīng)具有一定的遞增趨勢(shì) (r2=0.82，方程為y=13475x+65547)；然而，VEGF 4.0～10.0 ng/mL濃度梯度組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＞0.05)(圖3C)。以上CCD曝光時(shí)間均為3 min。

圖3 生物發(fā)光成像評(píng)價(jià)VEGF對(duì)H/R損傷后ADMSCs存活與增殖的影響 生物發(fā)光成像(A)、定量分析(B)和量效曲線(xiàn)(C)，提示VEGF(4.0～10.0 ng/mL)可促進(jìn)H/R損傷后ADMSCs的存活與增殖Fig.3 Bioluminescenceimaging of ADMSCsby VEGF pretreatment with H/R injury The images(A),chart(B)and dose-respose curve(C)indicate the effect of VEGF(1.0～10.0 ng/mL)on bioluminescence signal intensity of ADMSCs after H/R injury.The fluc average radiance of ADMSCs has a significant decrease after H/R injury,and VEGF(4.0～10.0 ng/mL)can promote the bioluminescence signal of ADMSCs

VEGF對(duì)H/R損傷后ADMSCs生存活力的影響

ADMSCs的MTT顯色深淺隨孔板中活細(xì)胞數(shù)增加而逐漸加深，其A值亦隨之升高。取A值均數(shù)計(jì)算細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示，對(duì)于正常培養(yǎng)條件下的ADMSCs，不同濃度的VEGF對(duì)其生存率的影響與對(duì)照組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＞0.05)，且無(wú)量效關(guān)系(r2=0.095)；然而，對(duì)于H/R損傷后的ADMSCs，5.0 ng/mL 〔(41±6.9)%〕～10.0 ng/mL 〔(55±4.4)%〕濃度的VEGF預(yù)處理可提高其生存率，與單純H/R損傷模型組 〔(28±3.7)%〕相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)，而1.0 ng/mL 〔(33±5.4)%〕～4.0 ng/mL 〔(29±2.7)%〕VEGF濃度組與單純H/R組相比則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＞0.05)。5.0～10.0 ng/mL VEGF濃度組之間對(duì)細(xì)胞活力的影響有增強(qiáng)的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＞0.05)，VEGF的量效呈弱直線(xiàn)相關(guān)關(guān)系(r2=0.78)(圖 4)。ADMSCs體內(nèi)移植后存活與增殖情況的分子影像監(jiān)測(cè)

生物自發(fā)光成像顯示，ADMSCs移植入裸鼠腓腸肌后，其體內(nèi)光學(xué)信號(hào)隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減弱 (圖5A)；MSCs組和MSCs+VEGF組ADMSCs移植后即刻，其fluc平均輻射度分別為 2.92×106±1.75×105和 2.95×106±1.31×105(P/s·cm2·sr)(P＞0.05)；而在移植后 7～21 天，MSCs+VEGF組ADMSCs的信號(hào)強(qiáng)度顯著高于MSCs組，第7天分別為2.54×106±9.64×104和 1.85×106±8.95×104(P/s·cm2·sr)(P＜0.05)，至第 21 天分別為 4.14×105±5.34×104和 1.15×105±4.26×104(P/s·cm2·sr)(P＜0.05)(圖 5B)。結(jié)果提示 10.0 ng/mL VEGF 可促進(jìn) ADMSCs體內(nèi)的增殖和存活，并延長(zhǎng)ADMSCs移植后的生存時(shí)間。

圖5 ADMSCs體內(nèi)移植后生物發(fā)光成像示蹤與定量 生物自發(fā)光成像和定量分析顯示，ADMSCs體內(nèi)移植后，其光學(xué)信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸減弱，而10.0 ng/mL VEGF預(yù)處理可促進(jìn)ADMSCs的體內(nèi)存活與增殖，并延長(zhǎng)ADMSCs移植后的生存時(shí)間Fig.5 In vivo visualization and quantification of implanted ADMSCs by bioluminescence imaging Bioluminescence imaging(A) and quantitative analysis(B)show that the fluc average radiance of ADMSCs has a time-dependent and gradual decrease after transplantation, while VEGF(10.0 ng/mL)pretreatment can enhance the ADMSCs'survival and proliferation in vivo

討 論

干細(xì)胞通過(guò)組織新生和旁分泌等作用促進(jìn)受損心肌組織再生，逐漸成為缺血性心臟病治療的新選擇[13]。干細(xì)胞的種類(lèi)多樣，其中骨髓來(lái)源的MSC(BMMSC)被證實(shí)可以提高心臟功能[14]，但受到其不易獲取、增殖能力較低等因素的局限。Zuk等[15]的研究表明，脂肪來(lái)源的MSC具有較強(qiáng)的增殖與分化潛能，或可作為再生醫(yī)學(xué)較好的細(xì)胞來(lái)源。因此，實(shí)驗(yàn)選取ADMSC作為目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行研究。

然而，在缺血心肌組織中，MSCs能否在相對(duì)缺氧的移植區(qū)域中生存，移植后細(xì)胞的生物學(xué)活性和增殖能力如何等，仍是MSCs治療面臨的巨大挑戰(zhàn)。對(duì)于研究者，最為關(guān)鍵的是尋找一種準(zhǔn)確、無(wú)創(chuàng)的監(jiān)測(cè)手段，對(duì)干細(xì)胞及其生物學(xué)狀態(tài)進(jìn)行示蹤與評(píng)估。

分子影像學(xué)技術(shù)可以在活體細(xì)胞和分子水平對(duì)干細(xì)胞的生物過(guò)程進(jìn)行成像和定量研究，對(duì)干細(xì)胞的高效、長(zhǎng)時(shí)程監(jiān)測(cè)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[8,16]。在以往的實(shí)驗(yàn)中，我們運(yùn)用分子影像學(xué)方法評(píng)價(jià)了攜帶多重報(bào)告基因人源ESCs的體外及體內(nèi)轉(zhuǎn)歸[16]。我們前期的分子影像研究還證實(shí)，BMMSCs心肌內(nèi)移植后，由于存活數(shù)量等因素，導(dǎo)致其長(zhǎng)期、有效的治療作用嚴(yán)重受限[6]。本研究中，我們選取穩(wěn)定攜帶報(bào)告基因β-actin-luc小鼠的脂肪組織為來(lái)源，在體外培養(yǎng)ADMSCs；通過(guò)生物自發(fā)光成像、細(xì)胞表面標(biāo)志流式細(xì)胞學(xué)鑒定及定量分析，證實(shí)該細(xì)胞具備MSCs的形態(tài)學(xué)與表型特點(diǎn)，能穩(wěn)定表達(dá)報(bào)告基因fluc，可以實(shí)現(xiàn)體外和體內(nèi)生物學(xué)過(guò)程的分子影像實(shí)時(shí)定量監(jiān)測(cè)。

同時(shí)，針對(duì)MSCs移植后的不良轉(zhuǎn)歸，我們選擇VEGF作為可能的保護(hù)因子進(jìn)行研究。VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)效促血管生成因子，具有促進(jìn)缺血組織血管形成和抗缺血組織凋亡的功能，并能促進(jìn)MSCs的血管新生作用[17]。我們前期的分子影像學(xué)研究也證實(shí)，誘導(dǎo)型表達(dá)VEGF165，可以提高移植小鼠ESCs的心臟功能與存活率[10]。

鑒于生物自發(fā)光信號(hào)可以直觀準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的生物學(xué)活性，因此，研究建立在以報(bào)告基因光學(xué)成像為主要監(jiān)測(cè)手段的干細(xì)胞影像學(xué)平臺(tái)上。首先通過(guò)建立H/R模型在體外模擬缺血再灌注損傷，觀察了H/R環(huán)境下ADMSCs的生物學(xué)活性變化以及VEGF預(yù)處理對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。體外生物發(fā)光成像結(jié)果表明：VEGF對(duì)常氧條件下生長(zhǎng)的ADMSCs活性無(wú)顯著影響；H/R損傷后，ADMSCs的生物學(xué)活性顯著下降，而一定濃度的VEGF（4～10.0 ng/mL）可以明顯提高H/R后ADMSCs的生存與增殖。這一結(jié)果也被MTT試驗(yàn)證實(shí)。我們還運(yùn)用生物發(fā)光示蹤進(jìn)一步定量監(jiān)測(cè)了ADMSCs體內(nèi)移植后的轉(zhuǎn)歸及VEGF對(duì)移植細(xì)胞的作用。結(jié)果顯示，VEGF能夠改善移植細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)歸，并延長(zhǎng)細(xì)胞在移植組織中的存活時(shí)間。

本研究以分子影像為主要監(jiān)測(cè)手段，實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)MSCs的無(wú)創(chuàng)可視化，并以此為基礎(chǔ)證實(shí)了VEGF可能是干細(xì)胞移植后存活的保護(hù)性因子。研究初步建立的可視化方法為有效評(píng)價(jià)體內(nèi)干細(xì)胞移植的長(zhǎng)期獲益、安全性及作用機(jī)制，改善干細(xì)胞的移植后轉(zhuǎn)歸，最終實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞治療缺血性心臟病的臨床轉(zhuǎn)化創(chuàng)造了有利條件。

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Molecular Imaging for Monitoring Survival and Proliferation of Adipose Derived Mesenchymal Stem Cellsin vitroandin vivoafter Pretreatment with VEGF

FAN Weiwei,WANG Yabin,ZHANG Rongqing,LI Congye,LI Shuang,CAO Feng
Department of Cardiology,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University；
Molecular Imaging Center,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China

This work was supported by grants from The National Natural Sciences Foundation of China(81090274,30970845)and Xijing Research Boosting Program on Stem Cell Research(XJZT08Z04)

Oct 20,2010 Accepted:Jan 17,2011

CAO Feng,Tel:+86(29)84771024,E-mail:wind8828@gmail.com

Although stem cell therapy holds promise for the regenerative treatment of ischemic heart disease,the tragic fate of engrafted stem cells is still a hurdle for the therapeutic effect.Previous studies showed that molecular imaging could be a realtime and quantitative effective approach to visualize and monitor stem cells,while vasoactive factors such as vascular endothelial growth factor(VEGF)may have protective effect on the stem cell.In this study,adipose tissue derived mesenchymal stem cells(ADMSCs),which stably expressed firefly luciferase gene,were cultured at the first step.Then bioluminescence imaging and other methods were used to visualize and quantify the ADMSCs'survival and proliferation,and confirmed whether VEGF pretreatment could affect the cells'viability.The results from bioluminescence imaging and quantitative analysis implied that VEGF pretreatment significantly enhanced the survival and proliferation of ADMSCs after hypoxia/reoxygenation injuryin vitro,and prolonged ADMSCs'lifetimein vivo.Eventually,it concluded that reporter genemolecular imaging could beadirect,efficient and noninvasive strategy for monitoring the MSCs'biological processin vitroandin vivo,while it could well evaluate the effect of protective factors,such as VEGF,on MSCs with high efficacy.

Molecular imaging;Mesenchymal stem cells;VEGF

2010-10-20；接受日期：2011-01-07

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81090274，30970845)；西京醫(yī)院助推計(jì)劃重大項(xiàng)目(XJZT08Z04)

曹豐，電話(huà)：(029)84771024，E-mail：wind8828@gmail.com

Q421

10.3724/SP.J.1260.2011.00345