石孟瓊，賀海波，盧訓(xùn)叢

珠子參（Panacis majoris rhizoma）為五加科植物珠子參植物的干燥根莖，具補肺養(yǎng)陰、祛瘀止痛、止血之功，主要用于氣陰兩虛、煩熱口渴、虛勞咳嗽、跌撲損傷、關(guān)節(jié)痹痛、咳血、吐血、衄血、崩漏、外傷出血等癥[1]。其化學(xué)成分主要為皂苷類（如珠子參苷、竹節(jié)參苷、人參皂苷、齊墩果酸、β-谷甾醇等），其次為多糖、倍半萜類以及人體必需微量元素（如Fe、Cu、Zn、Mn、Ni、Co、Mo等）[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，珠子參具有較廣泛的藥理作用，對心血管系統(tǒng)、血液及造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、腫瘤等均有作用[3～5]。研究還發(fā)現(xiàn)珠子參除具有強心、保護心肌缺血再灌注損傷外，其水提物對小鼠局灶性腦缺血和缺血再灌注損傷也具有較好的保護作用[6～7]。本實驗旨在此基礎(chǔ)上進一步研究其醇提物對小鼠局灶性腦缺血的影響，為珠子參進一步研究開發(fā)和臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性5周齡昆明小鼠（清潔級），25～30 g，由湖北省實驗動物研究中心提供（許可證號：SCXK(鄂) 2008-0005）。室溫(22±1)℃，濕度(60±5)%，12 h 明暗循環(huán), 自由飲食和飲水。

1.2 藥品和試劑

珠子參購自宜昌市中醫(yī)院，并經(jīng)植物與天然產(chǎn)物湖北省重點實驗室汪鋆植教授鑒定為五加科人參屬植物珠子參，藥材標本保存在三峽大學(xué)中藥藥理學(xué)三級實驗室。珠子參醇提物的制備：珠子參藥材烘干稱重，粉碎成粗粉，加10倍量60%的乙醇溶液，浸泡2 h后，加熱回流提取3次，每次3 h，合并濾液，濾過，得提取液。提取液減壓回收溶劑至無醇味，濃縮至生藥含量為1.0 gmL-1，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

尼莫地平片（亞寶藥業(yè)集團股份有限公司生產(chǎn)，批號090806），水合氯醛（上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)，五聯(lián)化工廠提供，批號060818），2 ,3 ,5-三苯基氯化四氮唑（TTC)（美國Sigma公司生產(chǎn)，上?；瘜W(xué)試劑公司進口分裝，批號060710），超氧化物歧化酶（SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPX)、丙二醛（MDA）、乳酸（LD）、乳酸脫氫酶（LDH）、Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、考馬斯亮藍試劑盒（南京建成生物工程研究所），其他試劑均為市售分析純。

1.3 實驗動物分組與給藥

將小鼠采用完全隨機設(shè)計分組法分為5組，分別為假手術(shù)組（n=20）、模型組（n=30）、尼莫地平組（2 mgkg-1，n=30）和珠子參醇提物低、中、高劑量組（2.5, 5.0, 10.0 gkg-1，每組n=30）。珠子參和尼莫地平分別在術(shù)前7 d 開始灌胃給藥，每日1次，缺血前0.5 h再給藥1次。假手術(shù)組和模型組灌胃給予等量蒸餾水。

1.4 小鼠局灶性腦缺血模型復(fù)制

于末次給藥0.5 h后，按照參考文獻[7]敘述的方法，建立小鼠短暫性的大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型。以動物清醒后行動不協(xié)調(diào)、爬行時向左轉(zhuǎn)圈、提尾時左前肢屈曲或作旋轉(zhuǎn)運動為制模成功標志。

1.5 行為學(xué)檢查

1.5.1 神經(jīng)癥狀評分 小鼠MCAO 24 h后的神經(jīng)癥狀參照Longa等[8]的分級法評分。0級：無癥狀；1級：提尾時損傷對側(cè)前肢不能伸直；2級：向損傷側(cè)旋轉(zhuǎn)；3級：向?qū)?cè)傾倒；4級：無自發(fā)活動或意識不清。1.5.2 斜板試驗 依據(jù)Yonemori等[9]的方法: 將MCAO 2 h，再灌注24 h小鼠放置在一平板(25 cm×15 cm)上,待動物在平板上站穩(wěn)后, 將平板從水平緩慢傾斜直至垂直, 記錄小鼠在平板傾斜時跌落的最大角度, 每只動物每次重復(fù)3次, 取平均值。

1.6 梗死面積及腦含水量的測量

進行完行為學(xué)檢查后，將實驗動物分成2部分，一部分斷頭處死，取出腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，稱濕質(zhì)量。然后冠狀均切4刀，共5片，將切片后的腦組織放置0.25% TTC溶液中，37℃避光孵育，每隔7～8 min翻動1次，染色30 min，10 %的福爾馬林固定并經(jīng)圖像掃描后用Image/J 圖像分析軟件測量梗死面積，計算梗死腦組織百分比。

梗死腦組織百分比=梗死區(qū)面積/(梗死區(qū)面積+非梗死區(qū)面積)× 100 %

測量完梗死面積后，然后將染色后的腦組織塊置入電熱恒溫烘箱（100±2）℃中烘干24 h至恒質(zhì)量,稱取干質(zhì)量。腦含水量用濕質(zhì)量的百分比表示。

腦含水量=(腦組織濕質(zhì)量-腦組織干質(zhì)量)/腦組織濕質(zhì)量×100%

1.7 腦組織氧化損傷指標的測定

實驗動物一部分斷頭處死，進行腦梗死面積和含水量的測量，另一部分在冰盤上迅速取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干后，用生理鹽水制成10%腦組織勻漿，3000 rpmmin-1，離心15 min，取上清液，用分光光度計法測定腦組織中的SOD、GSHPX、MDA、LD、LDH、Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP的含量，所有步驟嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件，單因素方差分析進行多組間差異的比較，Dunnett-t檢驗比較兩組間均數(shù)的差異；神經(jīng)癥狀評分結(jié)果用非參數(shù)Krukal-Wallis檢驗；缺血側(cè)與對側(cè)的腦體積和神經(jīng)元密度比較用配對t檢驗；小鼠死亡率用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 珠子參醇提物對局灶性腦缺血小鼠成活率的影響

小鼠局灶性腦缺血小鼠成活率統(tǒng)計時剔除模型組栓塞大腦中動脈時顱內(nèi)出血引起死亡的小鼠2只，珠子參醇提物低、中劑量組栓塞大腦中動脈時顱內(nèi)出血引起死亡的小鼠1只。 假手術(shù)組成活率為100.0%（20/20），模型組小鼠成活率為60.7%（17/28），用珠子參醇提物（2.5, 5.0, 10.0gkg-1）預(yù)處理后，其成活率分別為72.4%（21/29）、79.3%（23/29）和83.3%（25/30），與模型組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05＆P<0.01），陽性藥尼莫地平組的成活率為86.7%（26/30），與模型組比較極具統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01）。

2.2 珠子參水提物對局灶性腦缺血小鼠行為學(xué)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠出現(xiàn)嚴重的神經(jīng)功能散失（P<0.01），珠子參醇提物均能改善神經(jīng)癥狀，其改善作用隨劑量的增加而增強，珠子參醇提物（2.5, 5.0, 10.0 gkg-1）與模型組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05,P<0.01）；在斜板實驗中，6個組的傾斜角度在MCAO術(shù)前無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），在MCAO 24 h后，模型組小鼠，傾斜角度顯著下降，用珠子參醇提物預(yù)處理后，傾斜角度呈逐漸恢復(fù)，與模型組比較，珠子參醇提物三個劑量組均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05,P<0.01），珠子參醇提物中、高劑量幾乎與尼莫地平相當。結(jié)果見表1。

表1 珠子參醇提物對局灶性腦缺血小鼠神經(jīng)癥狀、斜板實驗角度的影響（ xˉ±s）

2.3 珠子參醇提物對小鼠局灶性腦缺血小鼠梗死面積、腦含水量的影響

同假手術(shù)組相比，模型組的梗死亡面積和腦含水量增大（P<0.01），造模成功。用珠子參醇提物預(yù)處理后，具有明顯改善作用，且隨劑量的增加而增強；與模型組比較，珠子參醇提物（2.5, 5.0,10.0 gkg-1）均能明顯降低腦梗死面積和腦含水量（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見圖1，表2 。

圖1 小鼠腦組織切片用0.25% TTC染色，10 %的福爾馬林固定后的典型照片

表2 珠子參醇提物對局灶性腦缺血小鼠梗死面積、腦含水量的影響（ xˉ±s）

2.4 珠子參醇提物對局灶性腦缺血小鼠腦組織勻漿生化指標的影響

與假手術(shù)組相比，模型組的MCAO小鼠腦組織內(nèi)MDA含量顯著升高、LD、LDH活性明顯增強(P< 0. 01)，而GSH-PX，SOD，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性明顯減少(P<0. 01)。與模型組相比，珠子參醇提物高、中劑量組可使MCAO小鼠腦組織內(nèi)MDA含量和LD、LDH活性顯著降低（P<0.05，P<0.01），同時GSH-PX和SOD活性明顯增加（P<0.05，P<0.01），顯著提高Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性(P<0.05，P<0.01)；而珠子參醇提物低劑量組除SOD和Ca2+-Mg2+-ATP酶與模型組相比有顯著差異外(P<0.05)，其余生化指標無顯著影響。綜合分析珠子參醇提物對局灶性腦缺血小鼠腦組織勻漿生化指標的檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其改善作用隨劑量的增加而增強，甚至高劑量組在降低MDA含量和改善GSH-PX、SOD活性方面優(yōu)于尼莫地平組。與模型組相比，尼莫地平也能顯著降低MCAO小鼠腦組織內(nèi)MDA含量和LD、LDH的活性（P<0.01），提高GSH-PX、SOD、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表 3。

表3 珠子參醇提物對局灶性腦缺血小鼠腦組織勻漿生化指標的影響（, n=8）

表3 珠子參醇提物對局灶性腦缺血小鼠腦組織勻漿生化指標的影響（, n=8）

注：與假手術(shù)組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01

組別 MDA GSH-PX SOD LD LDH Na+-K+-ATP Ca2+-Mg2+-ATP(gkg-1) (nmolmg-1) (Umg-1) (Umg-1) (μgmg-1) (μgmg-1) (μgmg-1) (μgmg-1)假手術(shù)組 8.68±1.90 21.25±3.23 100.2±7.5 3.47±0.76 9.80±1.81 3.35±0.64 2.24±0.43模型組 18.80±3.88 ## 14.15±2.28 ## 77.3±7.3 ## 7.52±1.55 ## 14.46±2.99 ## 1.88±0.39 ## 1.57±0.32 ##珠子參(2.50) 15.97±2.33 15.25±2.25 83.2±5.2* 6.39±0.93 12.28±1.79 2.13±0.23 1.82±0.23*珠子參(5.00) 15.34±2.00* 18.07±3.07* 85.3±6.6* 6.13±0.80* 11.80±1.54* 2.22±0.25* 1.91±0.25**珠子參(10.00) 12.43±2.64** 18.33±3.26** 87.3±5.9** 5.41±0.65** 11.22±0.95** 2.27±0.25** 1.95±0.26**尼莫地平(0.002g/kg) 13.53±1.61** 17.09±3.02* 86.0±5.4** 4.97±1.05** 10.26±1.24** 2.49±0.53** 2.07±0.44**

3 討論

腦血管病是臨床常見病、多發(fā)病，隨著社會的不斷進步，人民生活水平的提高，其發(fā)病率、病死率及致殘率呈逐年上升趨勢，由于其起病迅速、發(fā)病率、死亡率高, 嚴重威脅人類健康，因而保護腦缺血損傷成為了防治和減輕其危害的重要手段。

竹節(jié)參具有較廣泛的藥理作用，對消化系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等具有廣泛的藥理作用[3～4,11]。我們研究發(fā)現(xiàn)竹節(jié)參水提物預(yù)處理對冠脈結(jié)扎誘導(dǎo)大鼠急性心肌缺血損傷具有較強的保護作用[6～7]，結(jié)合前期珠子參水提物對小鼠局灶性腦缺血和缺血再灌注損傷均具有較好的保護作用[6～7]，為了進一步觀察竹節(jié)參對缺血性腦損傷的保護作用及可能的機制，我們設(shè)計了本實驗。實驗研究結(jié)果表明，珠子參醇提物能明顯增加局灶性腦缺血小鼠成活率，并且其療效隨劑量的增加而增強，在改善腦缺血小鼠行為學(xué)方面顯示出良好的療效；在腦形態(tài)學(xué)和腦含水量的分析中，我們發(fā)現(xiàn)珠子參醇提物能明顯減少腦缺血再灌注小鼠腦的梗死面積和降低腦含水量，顯示出了對局灶性腦缺血性損傷的良好保護作用。

研究表明，腦神經(jīng)功能與腦能量代謝密切相關(guān)，局部的腦缺血障礙，會使腦缺血、缺氧，引起能量代謝和離子平衡被破壞，導(dǎo)致腦組織損傷。而ATP酶是存在于組織細胞及細胞器（如線粒體）等生物膜上的一種逆化學(xué)梯度轉(zhuǎn)運離子的蛋白酶，其中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶與神經(jīng)系統(tǒng)關(guān)系密切，對維持神經(jīng)細胞的形態(tài)、離子濃度平衡及膜興奮性傳導(dǎo)等方面發(fā)揮十分重要的作用，其活性可以表示神經(jīng)細胞質(zhì)膜功能的狀態(tài)，它對維持線粒體膜內(nèi)、外H2O、Na+、Ca2+離子平衡起重要作用[12]。研究表明，當腦缺血缺氧時，細胞能量代謝障礙，一方面，使線粒體合成ATP受阻，依賴于ATP的離子泵Na+-K+-ATP酶活性降低，使得線粒體發(fā)生腫脹，而Ca2+-Mg2+-ATP酶活性降低使得線粒體內(nèi)Ca2+蓄積，使胞內(nèi)Na+、Ca2+排出障礙，形成惡性循環(huán)，加速細胞死亡[13～14]；另一方面，由于細胞內(nèi)能量不足，糖無氧代謝產(chǎn)生的LD增多和LDH大量釋放，CO2、H+等代謝產(chǎn)物堆積，造成細胞內(nèi)酸中毒和高滲透壓，導(dǎo)致腦細胞水腫，組織缺血引起酸中毒，加重腦損傷。實驗表明，珠子參醇提物預(yù)處理局灶性腦缺血模型小鼠能顯著改善腦能量代謝，增加腦組織缺血后Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，減少LD含量，降低神經(jīng)細胞膜的通透性，使LDH活性降低，減少酸中毒的發(fā)生。

近年來，隨著對自由基（H2-、H2O2、OH˙、NO及 ONOO-）研究的深入，逐漸證實了自由基的連鎖反應(yīng)，即氧自由基生成及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強是腦缺血性損傷的主要機制之一[10]。大量研究表明，自由基對健康的作用具有雙重性，低濃度自由基為維持健康所必須，如自由基參與細胞免疫，對于抗局部感染等具有一定的作用，在正常情況下，機體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和清除是平衡的；在腦缺血時很容易受到自由基的攻擊，導(dǎo)致自由基大量堆積，引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸的過氧化，使膜結(jié)構(gòu)遭到破壞、蛋白降解、核酸主鏈斷裂、透明質(zhì)酸解聚、細胞崩解、細胞發(fā)生不可逆改變，導(dǎo)致腦梗死的形成。因此，進行清除自由基的抗氧化治療將是腦缺血性損傷的重要治療手段之一。在實驗中，我們通過分析腦組織中與氧化損傷相關(guān)的指標發(fā)現(xiàn)，局灶性腦缺血模型小鼠腦組織中的氧化還原系統(tǒng)受到明顯破壞，提示小鼠行局灶性腦缺血術(shù)誘發(fā)了腦組織組織氧化損傷，實驗結(jié)果也與我們前期的研究結(jié)果一致[6～7]。當腦組織缺血時產(chǎn)生大量的氧自由基(及OH˙)，一方面，在超氧化物歧化酶的作用下生成H2O2，它又可通過Fenton反應(yīng)和Haber-weiss反應(yīng)生成OH-，另一方面， 與NO反應(yīng)形成ONOO-，引起細胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。而OH-是一種特別不穩(wěn)定氧化劑，可與細胞膜脂質(zhì)反應(yīng)，引發(fā)細胞膜脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，造成細胞死亡[15]。在實驗中，實驗小鼠經(jīng)珠子參醇提物預(yù)防治療后腦組織中SOD、GSH-PX酶的活性明顯升高，MDA含量顯著降低。通過與尼莫地平的對比分析，我們發(fā)現(xiàn)珠子參醇提物高劑量組在改善腦組織中GSH-PX和SOD酶活性和降低MDA含量方面優(yōu)于尼莫地平組。

因此，本實驗表明，珠子參醇提物可通過增強受損腦組織中ATP 酶的活性，減少酸中毒，改善腦能量代謝，通過改善受損腦組織中GSH-PX和SOD酶活性和降低MDA含量減輕缺血缺氧對腦組織的損傷，從而對局灶性腦缺血模型小鼠產(chǎn)生保護作用。

[1] 國家藥典委員會. 中國藥典(一部)[S]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2010:254.

[2] Morita, T, Kasai, R, Tanaka, O, et al. Saponins of Zu-Tziseng,rhizomes of Panax japonicus C.A. Meyer var. major (Burk.)C.Y. Wu et K.M. Feng, collected in Yunnan, China[J]. Chem.Pharm. Bull, 1982, 30 (10): 4341.

[3] Chan HH, Sun HD, Reddy MVB, et al. Potent α-glucosidase inhibitors from the roots of Panax japonicus C. A. Meyer var.major [J]. Phytochemistry, 2010, 71(11-12):1360.

[4] 趙仁,趙毅,李東明.珠子參研究進展 [J]. 中國現(xiàn)代中藥, 2008,10(7):3.

[5] Satoh,Y,Satoh,M,Isobe,K,et al. Studies on panax acetylenes:absolute structure of a new panax acetylene, and inhibitory effects of related acetylenes on the growth of L-1210 cells[J].Chem. Pharm. Bull, 2007, 55(4):561.

[6] 石孟瓊, 賀海波, 覃寧玲,等.珠子參水提物預(yù)處理對小鼠缺血再灌注損傷的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2011,33 (3):290.

[7] 蘇婧, 石孟瓊, 賀海波,等.珠子參水提物對小鼠急性腦缺血損傷的影響[J]. 中國老年學(xué)雜志, 2011, 31（錄用）.

[8] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats [J].Stroke, 1989, 20 (1):84.

[9] Yonemori F, Yamaguchi T, Yamada H, et al. Evaluation of a motor def i cit after chronic focal cerebral ischemia in rats [J]. J Cereb Blood Flow Metab, 1998, 18 (10):1099.

[10] 安晶晶,蔣寶泉,孫海嵐,等. 富硒SOD綠茶對老齡大鼠機體抗氧化能力的影響[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2009, 31 (7):608.

[11] Chen Tao, Hu Yueqin, Deng Lirong, et al. Effects of Polysaccharides Extracted from Zhu Zi Shen (Rhizoma Panacis Majoris) on oxidative stress and hemodynamics in the adriamycin-induced chronic congestive heart failure rat[J]. Journal of Traditional Chinese Medicine, SCI-E,2011,9.

[12] Stojanoric T, Mrsulja B. Alterat ion in synaptosmal membrane Na+, K+-ATPase of the gerbil cortex and hippocampus following reversible brain ischemia[J]. Metab Brain Dis,2003, 3 (4): 256.

[13] 張三妹,李光來. 阿米洛利對大鼠腦缺血再灌注損傷后ATP酶的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志, 2008, 6(2):186.

[14] 王玉鳳,李光來.二氮嗪對大鼠缺血再灌注損傷腦組織線粒體ATP酶活性的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2011, 9 (3): 337.

[15] Warner DS, Sheng H, Batini?-Haberle I. Oxidants,antioxidants and the ischemic brain [J]. J Exp Biol, 2004,207(Pt 18):3221.