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        HPLC法對(duì)細(xì)辛含藥血清中AAⅠ的含量測定

        2011-10-09 05:11:42黃必勝周禎祥黃保希
        中藥與臨床 2011年5期
        關(guān)鍵詞:血清

        黃必勝,周禎祥,黃保希

        1 儀器與試劑

        1.1 儀器

        戴安高效液相色譜儀:P680型輸液泵、在線脫水機(jī)、手動(dòng)進(jìn)樣器、TCC-100柱溫箱、PDA-100二極管陣列檢測器、chromeleon色譜工作站,戴安公司。

        1.2 試劑

        馬兜鈴酸A(AAⅠ):中國藥品生物制品檢定所(批號(hào):110746-200305);甲醇(色譜純):上海振興化工一廠;冰乙酸(分析純):天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心;重蒸餾水、細(xì)辛含藥血清和空白含藥血清:由課題組提供。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件

        色譜柱:D i a m o n T M O D S-C 1 8(2 5 0 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇-水-醋酸(72∶27∶1);柱溫:室溫;檢測波長:390 nm;流速:1 mLmin-1。

        2.2 AAⅠ對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白血清組溶液的制備

        精密稱取適量AAⅠ對(duì)照品8 mg,置于10 mL的容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,0.45 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,制得AAⅠ對(duì)照品溶液,避光保存?zhèn)溆?。精密量取?xì)辛含藥血清和空白血清各15 mg分別置于25 mL的容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,0.45 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,制得供試品溶液和空白對(duì)照組溶液,避光保存?zhèn)溆谩?/p>

        2.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

        取AAⅠ對(duì)照品溶液、供試品溶液及空白對(duì)照品溶液各20 μL,注入高效液相色譜儀按以上色譜條件測定,記錄色譜圖,結(jié)果見圖1~3。由圖1~3可知,AAⅠ的保留時(shí)間為16.833 min。

        2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備與線性考察

        精密吸取AAⅠ對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.06 mL,0.12 mL,0.3 mL,0.6 mL,3 mL,6 mL,分別置于10 mL的容量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,進(jìn)樣為20 μL,記錄峰面積,以AAⅠ對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見表1,圖4)。結(jié)果表明,AAⅠ峰面積在0.2~0.6 mgL-1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,最低檢測限為0.2 μgmL-1?;貧w方程為Y=7262.8X+2.4(r=0.9988,n=5)。

        表1 AAⅠ對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線測定峰面積

        圖4 AAⅠ對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

        2.5 精密度考察

        精密吸取AAⅠ對(duì)照品溶液20 μL,進(jìn)樣5次,得峰面積值的RSD=2.68%(n=5),結(jié)果表明儀器與色譜條件具有良好的精密度。結(jié)果見表2。

        表2 精密度考察(n=5)

        2.6 穩(wěn)定性考察

        取供試品溶液,在配制后0 h,4 h,8 h,12 h,16 h和24 h于同一色譜條件下分別進(jìn)樣20 μL,所得峰面積值的RSD=2.38%(n=6),表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。結(jié)果見表3。

        表3 穩(wěn)定性考察(n=6)

        2.7 加樣回收率考察

        精密吸取供試品溶液10 mL平行6份,分成3組,每組2份,分別加入AAⅠ對(duì)照品溶液0.5 mL,1 mL及2 mL,置于10 mL的容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,分別進(jìn)樣20 μL,記錄色譜圖。得出平均加樣回收率為100.02%,RSD=2.74%(n=6)。結(jié)果見表4。

        表4 加樣回收率考察(n=6)

        2.8 細(xì)辛含藥血清中AAⅠ含量測定

        分別取供試品溶液20 μL注入高效液相色譜儀分析,記錄峰面積,以外標(biāo)法計(jì)算AAⅠ的含量,結(jié)果供試品中AAⅠ的含量低于最低檢測限,故忽略不計(jì)其具體含量(表10)。

        表5 細(xì)辛含藥血清中AAⅠ含量測定(n=6)

        3 討論與體會(huì)

        馬兜鈴酸(aristolochic acid,AA)可引起腎臟損害的臨床報(bào)道和毒理研究已經(jīng)引起全世界的廣泛關(guān)注和高度重視。2000年5月,美國藥品與食品管理局(FDA)公布了含有AA的植物品種名單[1],其中涉及17種中藥材,馬兜鈴科細(xì)辛屬細(xì)辛被列在名單之中。

        AA可引起慢性腎臟損害,國外學(xué)者稱之為“中草藥腎病”(Chinese herbs nephropathy,CHN)[2]。國內(nèi)學(xué)者認(rèn)為[3~6],AA是引起CHN的主要毒性物質(zhì),而含AA的僅限于馬兜鈴屬的少數(shù)藥物,并非所有中藥都會(huì)引起腎損害。因此,國內(nèi)學(xué)者提出“馬兜鈴酸腎病”(aristolochic acid nephropathy,AAN)這一概念,得到了國內(nèi)外學(xué)者的普遍認(rèn)同。

        AA類物質(zhì)是3,4-次甲二氧基-10硝基-1菲類衍生物,是馬兜鈴科馬兜鈴屬植物所含的共有成分。AA主含AAⅠ,馬兜鈴酸B(AAⅡ)和馬兜鈴內(nèi)酞胺Ⅰ(ALⅠ)等,是目前公認(rèn)的毒性成分,其中AAⅠ含量最高[8]。據(jù)報(bào)道[7],AAⅠ對(duì)腎小管上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響具有一定的特征性,突出表現(xiàn)為細(xì)胞核的損傷。在急性AAN患者的腎活檢組織以及眾多AAN動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn),腎小管上皮細(xì)胞在發(fā)生急性損傷、壞死的同時(shí)并沒有出現(xiàn)增殖現(xiàn)象。提示AAⅠ及其代謝產(chǎn)物在直接損傷細(xì)胞的同時(shí),還抑制了細(xì)胞的增殖能力。李氏等[9]研究發(fā)現(xiàn),AAⅠ可致豬腎小管上皮細(xì)胞系LLC-PK1細(xì)胞DNA損傷,使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期,認(rèn)為這可能是AA腎損傷后腎小管上皮細(xì)胞再生修復(fù)能力差的機(jī)制之一。以上研究均表明,AAⅠ是AA造成腎損傷的主要毒性物質(zhì)。

        相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[10~11],AAⅠ在細(xì)辛藥材特別是在其根及根莖中含量很低,甚至痕量,以至于薄層色譜對(duì)其檢測不到,而必須用靈敏度高的方法才能檢測到。本實(shí)驗(yàn)用HPLC法檢測細(xì)辛含藥血清中AAⅠ,結(jié)果低于最低檢測限,說明細(xì)辛含藥血清中不含AAⅠ。因此,本研究認(rèn)為,細(xì)辛雖屬馬兜鈴科植物,但在常規(guī)使用下,是有效、安全的,不會(huì)引起腎毒或腎損傷。

        [1] 鮑志東,葉晨,黃欣.馬兜鈴屬植物的腎毒性[J].國外醫(yī)學(xué)中醫(yī)中藥分冊,2001,23(5):259.

        [2] 孫偉.對(duì)中草藥腎毒性的理性探討[J].江蘇中醫(yī),2001,22(10):1.

        [3] 諶貽璞,陳文.馬兜鈴酸腎病存在四種臨床病理類型[J].中華腎臟病雜志,2000,⑹:406.

        [4] 康亞國,宋曉群.對(duì)中藥毒性問題的認(rèn)識(shí)[J].陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2001,24(3):51.

        [5] 郭功玲,李吉華.對(duì)馬兜鈴酸腎病的新認(rèn)識(shí)[J].上海中醫(yī)藥雜志,2003,37(1):33.

        [6] 陳文,諶貽璞.馬兜鈴酸腎病的診斷與治療[J].醫(yī)師進(jìn)修雜志,2003,26(5):11.

        [7] 李恒,劉志紅,陳惠萍,等.馬兜鈴酸I對(duì)腎小管上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響[J].腎臟病與透析腎移植雜志,2001,10(3):242.

        [8] WangYins,PanJing-xian,GaoJian-Jun,et al.The antitumor con hlentsfrom stem of Aristolochiamanshuriensis[J]. Beijing MeclUniv,2000,32(1):18.

        [9] 李瑛,劉志紅,郭嘯華,等.馬兜鈴酸I致腎小管上皮細(xì)胞DNA損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J].腎臟病與透析腎移植雜志,2004,13(1):7.

        [10] 徐玫,李景華.細(xì)辛不同部位的馬兜鈴酸A及揮發(fā)油含量研究[J].藥物研究,2007,16(10):29.

        [11] 黃順旺.北細(xì)辛中不含馬兜鈴酸A的薄層色譜法鑒別[J].安徽醫(yī)藥,2003,7(4):299.

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