劉仁慧，許利平，楊婧

本實(shí)驗(yàn)在前期研究已建立的哮喘大鼠模型的基礎(chǔ)上[1]，給予地塞米松干預(yù)治療2周，并同時(shí)配合服用淫羊藿女貞子煎劑，觀察淫羊藿女貞子合激素干預(yù)治療對(duì)哮喘大鼠氣道炎癥、糖皮質(zhì)激素作用途徑等的影響作用，為后期應(yīng)用平補(bǔ)陰陽(yáng)中藥協(xié)同激素干預(yù)哮喘模型提供實(shí)驗(yàn)與理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，體重（120±10）g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)：SCXK-（軍）2007-004)。

1.2 試劑與藥品

卵清白蛋白（OVA）、氫氧化鋁凝膠、地塞米松（Dex），美國(guó) Sigma公司；地塞米松磷酸鈉注射液，天津藥業(yè)焦作有限公司；促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）、皮質(zhì)醇（COR）放免試劑盒，北京北方生物技術(shù)研究所；促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）放免試劑盒，北京華英生物技術(shù)研究所；大鼠IL-4、IL-5、INF-γ酶免試劑盒，上海朗頓生物科技有限公司；糖皮質(zhì)激素受體（GCR）單克隆一抗，美國(guó)Abcam；Fitc-GCR二抗，北京成文化學(xué)免疫研究室；Fitc- Dex，美國(guó)Molecular Probes。淫羊藿、女貞子藥材均購(gòu)于北京同仁堂藥店。

1.3 實(shí)驗(yàn)器材

402A超聲霧化器，江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司；霧化箱，以有機(jī)玻璃為材料自制，規(guī)格：40×30×20cm3；XH6080放免儀，西安核儀廠；酶標(biāo)儀，Denley Dragon Wellscan MK2型USA；流式細(xì)胞儀FACS Calibur，美國(guó)BD公司。

2 方法

2.1 分組方法

按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，即正常對(duì)照組（N組）、哮喘模型組（A組）、激素干預(yù)組（GC組），淫羊藿女貞子組（YN組），淫羊藿女貞子合激素干預(yù)組（YN+GC組），每組8只。

2.2 造模、給藥方法

實(shí)驗(yàn)d1-35，除正常對(duì)照組外，其余動(dòng)物全部造模[1]。實(shí)驗(yàn)d36-48，激素干預(yù)組、淫羊藿女貞子合激素干預(yù)組 ip 地塞米松注射液0. 5 mgkg-1，qd，連用2周；淫羊藿女貞子組、淫羊藿女貞子合激素干預(yù)組ig淫羊藿女貞子水溶液（9. 5 gkg-1），qd，連用2周；同時(shí)，除正常對(duì)照組外，其余動(dòng)物每周2 次給予1%OVA 霧化吸入直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

2.3 取材處理

大鼠腹腔麻醉, 腹主動(dòng)脈取血, 分離取血清及血漿。血清用于COR檢測(cè)；血漿用于ACTH 檢測(cè)。右肺行支氣管肺泡灌洗術(shù)，回收支氣管肺泡灌洗液（BALF），分離BALF上清液，用于IL-4、IL-5、INF-γ檢測(cè)，BALF沉淀加4%多聚甲醛固定，用于GCR檢測(cè)。斷頭后, 迅速摘取下丘腦，用于CRH 檢測(cè)。

2.4 觀測(cè)指標(biāo)與檢測(cè)方法

2.4.1 IL-4、IL-5、INF-γ 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用ELISA法檢測(cè)。

2.4.2 COR、ACTH、CRH 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用RIA法檢測(cè)。

2.4.3 GCR含量的檢測(cè) 采用流式細(xì)胞法。GCR蛋白表達(dá)檢測(cè)：BALF沉淀0.5 mL，PBS 洗2次；加入破膜劑（0.1% Triton-X 100 -10%山羊血清-PBS）重懸細(xì)胞，冰上靜置后離心，PBS 洗滌1次；吸棄上清，加入GCR一抗，同型對(duì)照管中加入等量IgGl，冰上避光靜置；PBS 洗滌1次，加入Fitc-GCR二抗，冰上避光靜置；PBS洗滌2次，棄上清；2%多聚甲醛重懸固定，4℃避光保存，上機(jī)檢測(cè)。GCR結(jié)合力檢測(cè)：BALF沉淀0.5 mL，PBS 洗滌2次；加入破膜劑重懸細(xì)胞，冰上靜置后離心，PBS洗滌2次；100 μLPBS重懸，37℃孵育10 min，加入2×10-5M Fitc-Dex，對(duì)照管提前10 min加入500倍于Fitc-Dex的Dex做為同型對(duì)照， 37℃，室溫避光靜置60 min，PBS洗滌2次，棄上清；2%多聚甲醛重懸固定，4℃避光保存，上機(jī)檢測(cè)。GCR的表達(dá)量用單細(xì)胞表達(dá)量的平均熒光強(qiáng)度表示。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±S）表示，組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)及單因素方差分析，根據(jù)方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果選擇LSD（方差齊）或Tamhane’s T2（方差不齊），采用SPSS 11.0 for Windows軟件包完成。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠BALF INF-γ、IL-4、IL-5的比較（見(jiàn)表1）

表1 各組大鼠INF-γ、IL-4、IL-5的比較（xˉ±S，n=10）

結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較，哮喘模型組BALF 中INF-γ含量明顯降低（P0.01），IL-4、IL-5含量明顯升高（P0.01、0.05）。與哮喘模型組比較，各給藥組均能顯著抑制升高的IL-4含量（均P0.01），此外淫羊藿女貞子合激素干預(yù)組可顯著升高INF-γ含量及INF-γ IL-4比值（P0.05、0.01），激素干預(yù)組可顯著升高INF-γ IL-4比值（P0.01）。

3.2 各組大鼠血清COR、血漿ACTH、下丘腦CRH含量的比較（表2）

表2 各組大鼠COR、ACTH、CRH的比較（xˉ±S，n=10）

結(jié)果顯示：COR、ACTH、CRH含量哮喘模型組較正常對(duì)照組均無(wú)差異，而激素干預(yù)組均較正常對(duì)照組、哮喘模型組顯著改變（P0.05或0.01）；淫羊藿女貞子合激素干預(yù)組與激素干預(yù)組比較，ACTH、CRH含量有顯著差異（均P0.01），COR含量有升高的趨勢(shì)。

3.3 各組大鼠BALF 中GCR蛋白表達(dá)和結(jié)合力的比較（表3）

表3 各組大鼠GCR蛋白的比較（xˉ±S，n=6）

結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較，哮喘模型組GCR蛋白結(jié)合力明顯降低（P0.01）。激素干預(yù)組GCR蛋白表達(dá)量及GCR蛋白結(jié)合力較正常對(duì)照組與哮喘模型組均降低明顯（P0.05或0.01）。與激素干預(yù)組比較，淫羊藿女貞子合激素干預(yù)組GCR蛋白表達(dá)量及GCR蛋白結(jié)合力均明顯升高（P0.05或0.01）。

4 討論

Th1/Th2細(xì)胞及其細(xì)胞因子的失衡是參與哮喘氣道炎癥的重要發(fā)病機(jī)制之一，研究表明[2～3]哮喘大鼠的Th1類細(xì)胞因子IFN-γ等表達(dá)明顯下降，Th2類細(xì)胞因子IL-4、IL-5等表達(dá)明顯上升，與本課題的研究結(jié)果吻合。GC抑制氣道炎癥的機(jī)制與其調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡有關(guān)，對(duì)Th1、Th2細(xì)胞均有抑制作用，而對(duì)Th2細(xì)胞的抑制作用更加顯著[4～5]。本課題研究表明：激素干預(yù)組能顯著抑制哮喘大鼠 IL-4水平，對(duì)IFN-γ的影響作用不顯著，提示GC調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡的作用主要體現(xiàn)在抑制Th2細(xì)胞功能亢進(jìn)。配伍中藥淫羊藿女貞子后，結(jié)果提示淫羊藿女貞子合激素干預(yù)組除具有同激素相似的抑制Th2功能亢進(jìn)的作用，且能顯著上調(diào)IFN-γ水平，升高IFN-γ/ IL-4比值，從而雙向調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡的作用，達(dá)到協(xié)同增效的作用。

哮喘存在低皮質(zhì)醇等HPA 軸不同程度的抑制現(xiàn)象，雖補(bǔ)充外源性GC是治療哮喘的首選方法，但大劑量地使用GC類藥物或長(zhǎng)期小劑量地使用此類藥物就會(huì)引起腎上腺皮質(zhì)功能的抑制[6～7]，從而導(dǎo)致內(nèi)源性COR含量顯著降低，下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸功能紊亂，GCR數(shù)量或功能亦出現(xiàn)異常。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：激素干預(yù)組血清COR 、BALF GCR蛋白表達(dá)及結(jié)合力均顯著降低，而ACTH及CRH含量反饋性增高，提示哮喘大鼠給予激素治療后，內(nèi)源性GC作用途徑受到顯著抑制。 GC合用淫羊藿女貞子配伍后，顯著下調(diào)ACTH、CRH含量，上調(diào)GCR含量及蛋白表達(dá)，從而對(duì)內(nèi)源性GC作用途徑起到保護(hù)作用，改善GC 類藥物對(duì)內(nèi)源性GC 的抑制。

[1] 劉仁慧,鄭君芳,袁穎,等.淫羊藿女貞子配伍調(diào)節(jié)哮喘大鼠NO/ET及HPA軸作用的研究[J].中國(guó)中藥雜志,2010,35(12):1590.

[2] 胡曉光,李昌崇,羅運(yùn)春,等.地塞米松對(duì)哮喘大鼠Th1/Th2失衡及嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的作用[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2004,20(5):615.

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