袁穎，郭忻 ，符勝光

氣道變應(yīng)性炎癥（allergic airway inf l ammation）是指氣道由變應(yīng)原誘發(fā)的炎癥反應(yīng)。常見的具有氣道變應(yīng)性炎癥的疾病主要有變應(yīng)性鼻炎(Allergic rhinitis, AR)和哮喘（asthma）。AR屬于上氣道變應(yīng)性疾病，哮喘屬于下氣道變應(yīng)性疾病。氣道變應(yīng)性炎癥反應(yīng)屬于Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，Th1/Th2細(xì)胞因子平衡失調(diào)，Th2類細(xì)胞因子增多，功能增強(qiáng)是氣道變應(yīng)性炎癥發(fā)生發(fā)展的重要因素[1]。黃芪和當(dāng)歸臨床常用于氣道變應(yīng)性疾病的治療。本研究在建立氣道變應(yīng)性炎癥的基礎(chǔ)上，以Th1、Th2的代表性細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4為指標(biāo)，探討了黃芪當(dāng)歸配伍對氣道變應(yīng)性炎癥大鼠Th1/Th2的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康SD大鼠，清潔級，雄性，48只，體重120±10 g。分籠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。隨機(jī)分為6組，每組8只。分別為空白對照組、模型對照組、黃芪組、當(dāng)歸組、芪歸配伍組、陽性對照組。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 OVA（Ⅴ級）：sigma公司。氫氧化鋁凝膠：sigma公司。一抗：購于美國Santa Cruz公司。EnVision試劑(HRP/Rabbit) 即用型購于丹麥Dako。IL-4大鼠ELISA試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司。IFN-γ大鼠ELISA試劑盒：invitrogen。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)用藥 黃芪：豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. vsr. mongholicus (Bge.)Hsiao.的干燥根。產(chǎn)地：甘肅。批號：091211

當(dāng)歸：傘形科植物當(dāng)歸 Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根。產(chǎn)地：甘肅。批號：091128

陽性對照藥：曲尼斯特膠囊，中國藥大制藥，批號：20070915。

1.1.4 主要儀器 402A超聲霧化器：江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司。IMS細(xì)胞圖象分析系統(tǒng)（醫(yī)學(xué)圖象分析軟件）：上海申騰信息技術(shù)有限公司。酶標(biāo)儀：BIO-TEK ELX800。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模方法

①致敏階段 于實(shí)驗(yàn)d1、d8，除空白對照組給予氫氧化鋁凝膠，各組動(dòng)物均以新鮮配制的1mgmL-1OVA氫氧化鋁凝膠致敏液作皮下注射，每鼠在兩側(cè)后足跖、腹股溝、腰、背、頸部共取10點(diǎn)，每點(diǎn)注射0.05 mL，同時(shí)腹腔注射0.5 mL，共計(jì)1 mL。

②激發(fā)階段 于實(shí)驗(yàn)d 15～d 36，將大鼠置于自制霧化箱內(nèi)，用超聲霧化器以校定的霧化量0.8mL/min/箱，霧化1%OVA激發(fā)液15 min，每日1次，以激發(fā)氣道變應(yīng)性炎癥?？瞻讓φ战M霧化以生理鹽水。觀察激發(fā)后動(dòng)物鼻部癥狀及呼吸變化。

1.2.2 給藥方法 黃芪水煎液、當(dāng)歸水煎液、黃芪＋當(dāng)歸（1∶1）水煎液，按10g（生藥）/kg（體重）灌胃給藥，每日1次?？瞻讓φ战M和模型對照組灌胃給予等體積的生理鹽水。陽性藥組給予曲尼斯特，34 mgkg-1。

1.2.3 取材處理 最后一次激發(fā)后24 h后，用25%烏拉坦（按4mLkg-1體重）進(jìn)行腹腔麻醉。迅速打開腹腔，腹主動(dòng)脈取血10 mL。迅速開胸，取出肺組織，浸泡于10%中性甲醛緩沖液中固定。取下動(dòng)物雙側(cè)鼻腔鼻黏膜，迅速放入10%中性甲醛溶液中。

1.2.4 免疫組化方法 參照丹麥 Dako公司免疫組化試劑盒Envision 系統(tǒng)操作說明。

常規(guī)4μm石蠟切片，貼在涂有切片粘合劑的干凈載玻片上，58℃烤18 h，常規(guī)二甲苯脫蠟至水；0.01 molL-1PBS（PH 7.4）洗3×3 min；用pH6.0 0.01M CB 熱誘導(dǎo)修復(fù)20 min，室溫自然冷卻，PBS洗3×3 min；0.3%H2O2抑制內(nèi)源性過氧化物酶20 min，室溫；PBS洗3×3 min；20%正常羊血清室溫孵育30 min, 不洗；滴加一抗37℃孵育 2h；PBS洗3×3 min；EnVision試劑(HRP/R)37℃ 30min；PBS洗3×3 min；DAB顯色8～12 min；蘇木素襯染色，熱水藍(lán)化；吹干后，樹脂封片；鏡下觀察，陽性產(chǎn)物呈棕黃色或黃色。每張切片分析3個(gè)視野，以高清晰度圖文分析系統(tǒng)測定免疫組化圖像中陽性細(xì)胞區(qū)域面積。

1.2.5 ELISA檢測方法 根據(jù)ELISA試劑盒說明書操作。酶標(biāo)儀450nm檢測。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）表示，組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)及單因素方差分析。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 11.0 for Windows軟件包完成。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

2.1 黃芪當(dāng)歸配伍對鼻黏膜IFN-γ、IL-4表達(dá)的影響

結(jié)果見表1。

表1 黃芪當(dāng)歸配伍對鼻黏膜IFN-γ、IL-4表達(dá)的影響(xˉ±SD，n=8)

表1結(jié)果表明：鼻黏膜IFN-γ表達(dá)，除黃芪組與模型對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P<0.05），其余各組之間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。鼻黏膜IL-4表達(dá)，模型組與空白對照組相比，IL-4表達(dá)增加（P<0.01）。當(dāng)歸組、芪歸配伍組和陽性對照組，IL-4表達(dá)與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。IFN-γ/ IL-4比值：模型組與空白對照組相比，IFN-γ/ IL-4表達(dá)降低（P<0.01）。當(dāng)歸組、芪歸配伍組和陽性對照組，IFN-γ/ IL-4與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.2 黃芪當(dāng)歸配伍對肺組織IFN-γ、IL-4表達(dá)的影響

結(jié)果見表2。

表2 黃芪當(dāng)歸配伍對肺組織IFN-γ、IL-4表達(dá)的影響(xˉ±SD，n=8)

表2結(jié)果表明：肺組織IFN-γ表達(dá)，模型組與空白對照組相比IFN-γ表達(dá)降低（P<0.01）。芪歸配伍組IFN-γ表達(dá)與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。肺組織IL-4表達(dá)：模型組IL-4表達(dá)升高，各給藥組表達(dá)與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01或P<0.05）。肺組織IFN-γ/ IL-4比值，模型組與空白對照組相比IFN-γ/ IL-4降低（P<0.01），黃芪組、芪歸配伍組及陽性對照組與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01或P<0.05）。

2.3 黃芪當(dāng)歸配伍對血清IFN-γ、IL-4含量的影響

結(jié)果見表3。

表3 黃芪當(dāng)歸配伍對血清IFN-γ、IL-4含量的影響((xˉ±SD，n=8)

表3結(jié)果表明：血清IFN-γ含量，模型組與空白對照組相比IFN-γ含量降低（P<0.05）。黃芪組和芪歸配伍組IFN-γ含量與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。血清IL-4含量：模型組IL-4含量升高，各給藥組表達(dá)與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01或P<0.05）。血清IFN-γ/ IL-4比值，模型組與空白對照組相比IFN-γ/ IL-4降低（P<0.01），黃芪組、芪歸配伍組及陽性對照組與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01或P<0.05）。

2.4 鼻與肺之間IL-4、IFN-γ的相關(guān)性分析

結(jié)果見表4。

表4 鼻黏膜及肺組織中IFN-γ、IL-4表達(dá)的相關(guān)性分析

表4結(jié)果顯示，鼻與肺之間IL-4、IFN-γ呈正相關(guān)性（P<0.01）。

3 討論

Thl和Th2細(xì)胞在機(jī)體免疫中發(fā)揮不同的作用。Th1細(xì)胞主要反映的是細(xì)胞免疫，Th1細(xì)胞占優(yōu)勢時(shí)，表現(xiàn)促炎為主，具有清除多種致病原的作用，主要抑制感染的發(fā)展，有助于病情康復(fù)或慢性感染的建立[2]；Th2細(xì)胞主要反映的是體液免疫，Th2細(xì)胞占優(yōu)勢時(shí)，表現(xiàn)抗炎為主，產(chǎn)生各種病理產(chǎn)物，傾向于引起嚴(yán)重的病理改變。而在氣道變應(yīng)性炎癥中，Thl/Th2平衡向著Th2細(xì)胞方向漂移。只有當(dāng)Thl／Th2處于動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，機(jī)體才處于健康狀態(tài)。Th1／Th2平衡調(diào)節(jié)也可認(rèn)為是陰陽平衡調(diào)節(jié)的一個(gè)方面[3]。

血為氣之母，氣為血之帥。黃芪當(dāng)歸藥對的配伍原則為氣血同治，為臨床所常用，以《內(nèi)外傷辨惑論》當(dāng)歸補(bǔ)血湯為代表。芪歸藥對既能自成一方，又可作為基礎(chǔ)藥對配伍組方，因而備受歷代醫(yī)家重視。而黃芪和當(dāng)歸也常用于氣道變應(yīng)性疾病的治療。如已有的藥理研究證實(shí)，黃芪能活化T細(xì)胞，誘生IFN-γ、CSFs及增強(qiáng)淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞活性等，表現(xiàn)出于其增強(qiáng)機(jī)體免疫有關(guān)的固有補(bǔ)氣作用。黃芪可以增強(qiáng)下丘腦一垂體一腎上腺皮質(zhì)功能，調(diào)節(jié)變Th1和Th2型細(xì)胞因子的平衡[4]～[5]，能改善哮喘患者的通氣功能，降低氣道高反應(yīng)性[6]。

本研究結(jié)果顯示模型組鼻黏膜、肺組織及血中IFN-γ降低、IL-4升高，且鼻黏膜與肺組織中相應(yīng)指標(biāo)具有一定相關(guān)性。單味黃芪可升高血及鼻黏膜中IFN-γ，降低血及肺中IL-4；單味當(dāng)歸可降低血、鼻黏膜及肺組織IL-4；黃芪當(dāng)歸配伍可升高血及肺組織IFN-γ，降低血、鼻黏膜及肺IL-4。提示黃芪當(dāng)歸配伍可調(diào)節(jié)氣道變應(yīng)性炎癥中局部及全身Th1/Th2細(xì)胞因子平衡，抑制Th2類細(xì)胞因子、促進(jìn)Th1類細(xì)胞因子，使平衡向Th1方向逆轉(zhuǎn)，從而對氣道變應(yīng)性炎癥有抑制作用。

[1] Larche M,Robinson DS,Kay AB.The role of T lymphocytes in the pathogenesis of asthma[J].Allergy Clin Immunol,2003,111(3):450.

[2] Chen RF,Yeh WT,Yang MY,et al.A model of the real time correlation of viral titers with immunere actions in antibody dependent enhancement of dengue 2 infections[J].FEMS Immunol Med Microbiol,2001,30:17.

[3] 吳婷婷,汪悅. Thl／Th2平衡紊亂與中醫(yī)證本質(zhì)之關(guān)系[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2006,15(6):827.

[4] 趙福東,董競成,謝瑾玉,等.補(bǔ)腎、益氣中藥對哮喘模型大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)若干指標(biāo)的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2007,27(8):715.

[5] 張薇,趙菲.黃芪對兒童變應(yīng)性鼻炎血清Th1／Th2的影響[J].中國藥物與臨床,2006,6(9):680.

[6] 張潔,孫秀珍,田蓉,等.黃芪對哮喘患者氣道反應(yīng)性的影響[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,27(8):701.