孟立，張艷麗，許欣，王子玉，閆益波，龐訓(xùn)勝，鐘部帥，黃榮，宋洋，王金玉，王鋒

1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)中心，南京 210095

2 揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，揚(yáng)州 225009

人乳鐵蛋白cDNA基因乳腺表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

孟立1，張艷麗1，許欣1，王子玉1，閆益波1，龐訓(xùn)勝1，鐘部帥1，黃榮1，宋洋1，王金玉2，王鋒1

1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)中心，南京 210095

2 揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，揚(yáng)州 225009

為了構(gòu)建人乳鐵蛋白基因 (hLF) 的乳腺表達(dá)載體并驗(yàn)證其在乳腺細(xì)胞中的表達(dá)情況，本載體以山羊 β-casein基因上游包括啟動(dòng)子、外顯子1、內(nèi)含子1、部分外顯子2作為5′端調(diào)控序列，下游包括部分外顯子7、內(nèi)含子7、外顯子8、內(nèi)含子8、外顯子9及3′部分基因組片段作為3′端調(diào)控序列，長度分別為6.2 kb和7.1 kb，將hLF基因 (目的基因) 和Neo基因 (篩選標(biāo)記) 分別插入到5′端調(diào)控序列和3′端調(diào)控序列的下游，構(gòu)建成pBC1-hLF-Neo載體，其全長為25.348 kb。為了檢測該載體的生物學(xué)功能，用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將其分別導(dǎo)入到山羊乳腺上皮細(xì)胞GMC和小鼠乳腺癌細(xì)胞株C127中進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證，經(jīng)G418抗性篩選8~10 d，得到了藥物抗性細(xì)胞克隆，經(jīng)催乳素、胰島素及氫化可的松誘導(dǎo)培養(yǎng)，通過RT-PCR、Western blotting以及重組hLF抑菌圈試驗(yàn)表明，山羊β-casein基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的hLF基因能夠在C127和GMC乳腺上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄翻譯，且重組hLF具有抑制大腸桿菌生長的生物活性，這為下一步建立穩(wěn)定整合hLF基因奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞系奠定了基礎(chǔ)。

hLF，pBC1-hLF-Neo，GMC細(xì)胞，C127細(xì)胞，生物學(xué)功能

Abstract:The aim of this study was to construct a mammary gland-specific expressional vector pBC1-hLF-Neo for Human Lactoferrin (hLF) gene and then investigate its expression in the mammary gland epithelium cells. The constructed vector contained the 6.2 kb long 5′ flank regulation region including promoter, other elements and the 7.1 kb long 3′ flank regulation region includingtranscriptional ending signal of a goat’s β-casein gene. A cassette of Neo gene was also inserted into the vector which gave a total length of 26.736 kb identified by restriction fragment analysis and partial DNA sequencing. The results revealed that the structure of the final constructed vector accords with the designed plasmid map. In order to analyze the bioactivity of the vector, we transfected the lined vector DNA into the dairy goat′s mammary gland epithelium cells and C127 cells of a mouse′s mammary epithelium by Lipofectamine. After selection with G418 for 8?10 days, G418-risistant clones were obtained. PCR analysis demonstrated that hLF gene cassette had been integrated into the genomic DNA of G418-risistant clones. After proliferation culture, the two kinds of transgenic cells were cultured in serum-free DMEM-F12 medium with prolactin, insulin and hydrocortisone- a medium capable of inducing recombinant hLF expression. RT-PCR, Western blotting and anti-bacteria bioactivity experiments demonstrated that the constructed mammary gland specific vector pBC1-hLF-Neo possessed the desirable bioactivity to efficiently express and could secrete hLF in both mammary gland cells and have the effect of E. coli proliferation inhibition. Paramount to everything, this study laid a firm foundation for preparing the hLF gene transgenic goat fetal-derived fibroblast cells.

Keywords:human lactoferrin, pBC1-hLF-Neo, GMC cells, C127 cells, biological function

人乳鐵蛋白是一種具有高級(jí)空間結(jié)構(gòu)的糖蛋白[1]，具有廣泛的生物學(xué)作用。大量體內(nèi)外試驗(yàn)表明：hLF不僅在腸道鐵離子[2]的吸收以及抵抗細(xì)菌[3]、病毒[4]、真菌、單細(xì)胞生物[5]等方面發(fā)揮重要作用，而且在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[6]、調(diào)控基因表達(dá)[7]及促進(jìn)骨骼生長方面[8]也具有重要功能。因此，hLF在疾病防治[9]、營養(yǎng)補(bǔ)充[10]、食物或藥品的貯藏等[11]方面具有廣闊的應(yīng)用前景，已成為近幾年來研究的熱點(diǎn)之一。人乳鐵蛋白轉(zhuǎn)基因奶羊不但可用于生產(chǎn)重組人乳鐵蛋白，而且可以改變羊奶的營養(yǎng)成分，使其品質(zhì)更接近于人乳，從而可以提高羊奶的應(yīng)用價(jià)值[12]。

制備轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白基因奶山羊的第一步是構(gòu)建hLF乳腺表達(dá)載體，構(gòu)建一個(gè)合理和有效的乳腺表達(dá)載體需要考慮多種因素，其中乳蛋白上游調(diào)控序列、目的基因及下游調(diào)控序列是其中3個(gè)最基本的要素。本研究將hLF cDNA克隆入以山羊β-酪蛋白基因作為調(diào)控序列的pBC1載體中，構(gòu)建了hLF基因的乳腺表達(dá)載體pBC1-hLF-Neo，此載體可以作為其他外源基因在動(dòng)物乳腺中進(jìn)行表達(dá)的通用載體。并將此表達(dá)載體利用脂質(zhì)體包裹的方法分別轉(zhuǎn)入到山羊乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺上皮細(xì)胞中，并在細(xì)胞中表達(dá)出了具有免疫和生物活性的重組人乳鐵蛋白，這為下一步制備穩(wěn)定表達(dá)重組人乳鐵蛋白的轉(zhuǎn)基因克隆山羊奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑

hLF cDNA[12]由上海轉(zhuǎn)基因中心惠贈(zèng)；質(zhì)粒pBC1由揚(yáng)州大學(xué)成勇教授惠贈(zèng)；C127細(xì)胞系為本實(shí)驗(yàn)室保存；PCR引物的合成及載體測序均由上海英駿公司完成；大腸桿菌DH5α和TOP10菌株系本試驗(yàn)室保存。所有的工具酶和高保真 DNA聚合酶購自 NEB公司；LA Taq聚合酶、RNAiso Plus、pMD19-T載體均購自TaKaRa公司；DNA純化試劑盒、Wizard DNA純化系統(tǒng) (A7280)、逆轉(zhuǎn)錄酶AMV購自 Promega公司；Lipofectamine? 2000和Lipofectamine? LTX、DMEM-F12、胎牛血清 (FBS)、G418、pcDNA3.1(-) 購自 Invitrogen公司；基因組提取試劑盒購自 TIANGEN生物公司；表皮生長因子 (EGF)、胰島素、催乳素、氫化可的松均購自Sigma公司；人乳鐵蛋白單克隆抗體購自Abcam公司；Western blotting試驗(yàn)常規(guī)試劑購自南京凱基生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 hLF乳腺表達(dá)載體的構(gòu)建及酶切鑒定

設(shè)計(jì)并合成一對(duì)特異性引物，利用Phusion高保真聚合酶擴(kuò)增hLF的cDNA，在上下游引物兩端分別引入XhoⅠ單酶切位點(diǎn)，長度為2 136 bp，將其克隆到PMD19-T載體上測序保存。用XhoⅠ分別酶切pBC1和 PMD19-T-hLF，使用熱敏磷酸酶將酶切后的pBC1去磷酸化后，將pBC1和hLF通過T4 DNA連接酶連接，通過菌液PCR和酶切鑒定得到正確重組質(zhì)粒命名為pBC1-hLF。

設(shè)計(jì)并合成一對(duì)特異性引物P3/P4，擴(kuò)增新霉素抗性基因Neo及其調(diào)控序列，以pcDNA3.1為模板，利用高保真聚合酶Phusion擴(kuò)增出長度為1 613 bp的 SV40-Neo-PolyA的片段，兩邊酶切位點(diǎn)為NotⅠ，擴(kuò)增出的片段克隆到PMD19-T載體上，測序正確后，連接到pBC1-hLF載體上的NotⅠ酶切位點(diǎn)處，鑒定方向，測序，正確重組質(zhì)粒命名為pBC1-hLF-Neo，以上過程所用引物見表 1，載體構(gòu)建過程詳見圖1。

1.2.2 山羊乳腺上皮細(xì)胞的制備及原代培養(yǎng)

無菌采取泌乳期的關(guān)中奶山羊乳腺組織，用PBS培養(yǎng)液洗數(shù)次，剝除其他組織后，將乳腺組織剪成1 mm3小塊，均勻放置直徑60 cm培養(yǎng)皿中，在37 ℃、5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，等組織塊貼壁后，加入1 mL的培養(yǎng)液 (DMEM-F12+10% FBS+10 ng/mL EGF+1%胰島素+100 U/mL青霉素+ 100 μg/mL鏈霉素)，第2 天補(bǔ)加3 mL培養(yǎng)液，以后每隔3天換1次液。傳代2~3次，除去成纖維細(xì)胞，以獲得山羊乳腺上皮細(xì)胞。C127細(xì)胞培養(yǎng)液同上。

1.2.3 山羊乳腺上皮細(xì)胞GMC和小鼠乳腺上皮細(xì)胞C127細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與篩選

將生長狀態(tài)良好的GMC和C127細(xì)胞按2×105分別接種于六孔板，培養(yǎng) 24 h，待細(xì)胞生長至80%~90%匯合后，按照Lipofectamine?轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染pBC1-hLF-Neo載體。轉(zhuǎn)染48 h后，用胰蛋白酶消化每孔細(xì)胞，接種于60 mm培養(yǎng)皿中，分別加入G418至終濃度500 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)，每3天換液1次，8~10 d后，將兩種細(xì)胞的G418抗性細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng)、冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 外源基因的整合鑒定

收集擴(kuò)大培養(yǎng)的G418抗性GMC和C127細(xì)胞，分別提取基因組DNA，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物 (表1) P7/P8和 P9/P10 檢測 hLF 轉(zhuǎn)錄盒子 (5′β-酪蛋白+hLF+3′β-酪蛋白) 是否整合到兩種細(xì)胞基因組DNA中。引物P7和P8分別取自5′端β-酪蛋白調(diào)控序列和hLF基因序列，引物 P9/P10分別取自 hLF序列和 3′端 β-酪蛋白調(diào)控序列。

表1 引物序列及PCR反應(yīng)程序Table 1 Primer sequences and PCR parameters

圖1 pBC1-hLF-Neo載體構(gòu)建示意圖Fig. 1 Construction of the pBC1-hLF-Neo mammary specific expression vector.

1.2.5 陽性細(xì)胞的激素誘導(dǎo)培養(yǎng)

將轉(zhuǎn)基因GMC細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因C127細(xì)胞分別鋪板，待細(xì)胞長至平皿80%時(shí)棄上清，分別加入誘導(dǎo)培養(yǎng)液 (DMEM-F12+10 μg/mL 胰島素+5 μg/mL 催乳素+10 μg/mL氫化可的松) 進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每隔6 h收集1次細(xì)胞上清，連續(xù)收集12次。選擇非轉(zhuǎn)基因的GMC細(xì)胞和C127細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

1.2.6 RT-PCR檢測目的基因hLF在mRNA水平上的表達(dá)情況

提取誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞總RNA，以1 μg總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈，后以 cDNA為模板，使用引物 P15/P16檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后是否有hLF基因在mRNA水平的表達(dá)，同時(shí)用山羊內(nèi)參基因GAPDH和小鼠β-actin基因作為內(nèi)參對(duì)照。

1.2.7 Western blotting檢測hLF蛋白分泌情況

將收集到的細(xì)胞上清進(jìn)行濃縮，進(jìn)行 12%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)到正電荷尼龍膜 (PVDF)，在封閉液中封閉2 h后，在4 ℃環(huán)境中和一抗Anti-Human Lactoferrin孵育過夜，一抗?jié)舛葹?∶1 000稀釋，后與二抗 (1∶1 000) 孵育1 h，洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光，膠片曝光顯影。詳細(xì)操作步驟見文獻(xiàn)[13]。

1.2.8 細(xì)胞上清中重組人乳鐵蛋白的抑菌試驗(yàn)

取10 mL轉(zhuǎn)基因細(xì)胞上清液置于凍干機(jī)中凍干處理后，然后溶解于細(xì)胞培養(yǎng)液中，離心除去雜質(zhì)后備用。將DH5α菌株接種于無菌LB液體培養(yǎng)基中于37 ℃、220 r/min培養(yǎng)12~14 h，OD值為1.4~1.6為宜。取一定量的菌體均勻地平鋪于無菌 LB瓊脂固體培養(yǎng)板上，待其凝固后，將直徑為6 mm的無菌濾紙片均勻地放于瓊脂板上，分別滴加20 μL轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的上清液樣品滴于濾紙片上，后用封口膜將培養(yǎng)板封口后置于 37 ℃培養(yǎng)箱中過夜，觀察抑菌圈的大小。試驗(yàn)中，以非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞上清液、細(xì)胞培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳腺特異性表達(dá)載體pBC1-hLF-Neo的鑒定

經(jīng)過 XhoⅠ單酶切得到了 23.215 kb+2.133 kb的酶切片段，經(jīng)過 NotⅠ單酶切得到了 23.669 kb+1.613 kb的片段，酶切鑒定結(jié)果見圖2A；通過PCR反應(yīng)，使用引物P7/P8和P3/P4，分別得到了大小為1 981 bp (包含了載體和hLF的部分序列) 和1 687 bp(包含了載體和 Sv40-Neo-poly的部分序列) 的目的片段，PCR鑒定結(jié)果見圖2B。pBC1載體與目的片段的連接處測序結(jié)果如圖2C和2D所示。證明所構(gòu)建的載體結(jié)構(gòu)完全正確。

2.2 山羊乳腺上皮細(xì)胞GMC和C127細(xì)胞的培養(yǎng)

乳腺組織塊培養(yǎng)7~10 d后左右周圍開始出現(xiàn)乳腺上皮細(xì)胞，細(xì)胞沿小組織塊周圍向外生長。隨后長出成纖維細(xì)胞。根據(jù)乳腺上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對(duì)消化酶敏感性的不同，可將二者分離。經(jīng)過2~3次傳代培養(yǎng)可得到純化的山羊乳腺上皮細(xì)胞 (圖3)。

圖2 載體pBC1-hLF-Neo酶切鑒定，插入方向鑒定電泳圖和部分連接處測序結(jié)果Fig. 2 Identification of vector pBC1-hLF-Neo by enzyme digestion, PCR amplificationand partial sequencing. (A) Identification of vector pBC1-hLF-Neo by enzyme digestion. 1: 200 bp marker; 2: product digested by XhoⅠ; 3: product digested by NotⅠ; 4:pBC1-hLF-Neo plasmid; 5: λ-Hind Ⅲ marker.(B) Identification of vector pBC1-hLF-Neo by PCR amplification. 1,5: λ-Hind Ⅲmarker and 200 bp DNA marker, respectively; 2: The plasmid pBC1--hLF-Neo; 3: the product with the primer P7/P8; 4: the product with the primer P5/P6. (C) DNA chromatogram of the sequence at the linking position between 3′ goat β -casein gene promoter and the hLF gene coding sequence. (D) DNA chromatogram of the sequence at the linking position between 3′ goat β -casein gene promoter and the Neo gene coding sequence.

圖3 培養(yǎng)的山羊乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺上皮細(xì)胞Fig. 3 The cultivated goat mammary epithelium cells and C127 cells. (A) Primary cultural goat mammary epithelium cells on 13th day. (B) Purified goat Mammary epithelium cells. (C) C127 cells.

2.3 乳腺上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及目的基因的整合

乳腺表達(dá)載體 pBC1-hLF-Neo分別轉(zhuǎn)染兩種乳腺上皮細(xì)胞后，經(jīng)過G418篩選8~10 d后獲得了抗性細(xì)胞克隆。由于本試驗(yàn)?zāi)康氖菣z測hLF的表達(dá)情況及驗(yàn)證所構(gòu)建載體是否有效，故在本試驗(yàn)中并未對(duì)這兩種乳腺細(xì)胞抗性單克隆進(jìn)行分離純化，而是分別將一種細(xì)胞的抗性單克隆收集在一起，將培養(yǎng)液中的G418篩選濃度減半成維持濃度250 ng/μL，對(duì)抗性克隆集中擴(kuò)大培養(yǎng)。提取細(xì)胞基因組DNA，PCR擴(kuò)增hLF轉(zhuǎn)錄表達(dá)盒，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞無目的條帶，而 G418抗性細(xì)胞則有目的條帶 (圖 4)，表明 hLF轉(zhuǎn)錄表達(dá)盒已經(jīng)完整地整合到這兩種細(xì)胞的基因組DNA中。

圖4 藥物抗性細(xì)胞PCR鑒定結(jié)果Fig. 4 PCR analysis of drug-resistant cell colonies. 1?2: PCR products of GMC cells as negative control; 3?4: PCR products of G418-resistant GMC cells by P9/P10 and P7/P8,individually; 5: 200 bp DNA marker; 6?7: PCR products of G418-resistant C127 cells by P7/P8 and P9/P10, individually;8?9: PCR products of C127 cells as negative control.

2.4 RT-PCR檢測 hLF基因在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中的表達(dá)

RT-PCR結(jié)果如圖5所示，在圖5A中，細(xì)胞為GMC，內(nèi)參基因?yàn)樯窖騁APDH基因，模板分別為經(jīng)過激素誘導(dǎo)培養(yǎng)的非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的RNA及反轉(zhuǎn)錄成的cDNA。以RNA為模板進(jìn)行PCR沒有擴(kuò)增出條帶，證明提取的總RNA中沒有細(xì)胞基因組DNA的污染；以激素誘導(dǎo)培養(yǎng)過的非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的 cDNA作為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增也不能得到條帶，但是以激素誘導(dǎo)培養(yǎng)過的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的 cDNA作為模板，則可以得到長度為2 067 bp的目的條帶。圖5B中細(xì)胞為C127，內(nèi)參基因選擇為小鼠β-actin基因，結(jié)果與前者相似。從而證明hLF基因已經(jīng)穩(wěn)定整合進(jìn)了兩種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的基因組 DNA中且都能進(jìn)行RNA水平上的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，且在兩種細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果一致。

圖5 兩種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中的hLF基因mRNA表達(dá)檢測Fig. 5 RT-PCR analysis of recombinant hLF transcription in two kinds of transgenic cells. (A) GMC cell. (B) C127 cell. M:200 bp DNA marker. 1?3: PCR with cDNA samples of the transgenic cells on induction at 24, 48, and 72 h; 4: PCR with cDNA samples of the non-transgenic cells by induction; 5: PCR with RNA samples of the transgenic cells by induction.

2.5 Western blotting檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞分泌目的蛋白

收集誘導(dǎo)培養(yǎng)的兩種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞上清液，經(jīng)Western blotting檢測，在73 kDa處都有特異性條帶形成，而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞無條帶 (圖 6)，表明轉(zhuǎn)基因細(xì)胞經(jīng)激素誘導(dǎo)后，山羊 β-酪蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的hLF cDNA基因能夠轉(zhuǎn)錄翻譯成hLF蛋白，而且能進(jìn)行翻譯后加工形成糖蛋白分泌到細(xì)胞外；同時(shí)也說明了hLF在兩種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的蛋白翻譯、加工成熟、分泌到胞外的修飾過程和調(diào)節(jié)機(jī)制是一致的。

2.6 重組人乳鐵蛋白的生物活性檢測

抑菌圈試驗(yàn)可以檢測重組目的蛋白是否具有生物活性，本試驗(yàn)結(jié)果如圖 7所示，在滴有兩種轉(zhuǎn)基因乳腺上皮細(xì)胞液的濾紙片外可以看到明顯的抑菌圈，但是山羊乳腺上皮細(xì)胞的抑菌圈直徑明顯大于小鼠乳腺上皮細(xì)胞，原因可能與hLF基因在細(xì)胞基因組中的整合位置有關(guān)[14]。而在滴有非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞液和普通細(xì)胞培養(yǎng)液的濾紙上則沒有觀察到抑菌圈。這說明轉(zhuǎn)基因乳腺上皮細(xì)胞所表達(dá)的重組人乳鐵蛋白具有抑制大腸桿菌生長的生物學(xué)功能。進(jìn)一步說明了載體具有完整的生物學(xué)功能。

圖6 Western blotting檢測重組hLF在細(xì)胞上清中的分泌Fig. 6 hLF protein secretion detected by Western blotting. M:protein marker; 1: supernatant of induction culture of the transgenic goat mammary epithelium cells at 48 h; 2:supernatant of induction culture of the normal mammary epithelium cells at 48 h, negative control; 3: supernatant of induction culture of the transgenic C127 cells at 48 h; 4:supernatant of induction culture of the normal C127 cells at 48 h, negative control.

圖7 重組hLF大腸桿菌抑菌環(huán)試驗(yàn)Fig. 7 Anti-bacteria bioactivity of recombinant hLF expressed by transferred cells. 1: 20 μL medium supernatant cultivating goat mammary epithelium transfected cells. 1′: 20 μL medium supernatant cultivating non-transfected cells; 2: 20 μL medium supernatant cultivating transfected C127 cells; 2′: 20 μL medium supernatant cultivating non-transfected C127 cells; 3:20 μL normal cell cultivating medium as negative control.

3 討論

本研究中使用的基礎(chǔ)載體為pBC1[15-16]，該載體是一種乳腺特異性表達(dá)載體，包含了以下真核表達(dá)功能元件：山羊β酪蛋白5′端調(diào)控區(qū)、山羊β酪蛋白 3′端非翻譯區(qū)、雞的 β-珠蛋白基因絕緣子。山羊酪蛋白5′端調(diào)控區(qū)長達(dá)6.2 kb，含有β酪蛋白的啟動(dòng)子能使hLF cDNA在乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá)，而其含有的基因組成分 (部分內(nèi)含子、外顯子) 能有效提高目的蛋白的表達(dá)水平；山羊β酪蛋白3′端調(diào)控序列長達(dá) 7.1 kb，其內(nèi)含子可以提高外源基因的表達(dá)水平，其 3′端非翻譯區(qū)，決定翻譯終止并參與 hLF mRNA多聚腺苷酸化；雞的珠蛋白基因絕緣子可在表達(dá)載體隨機(jī)整合入動(dòng)物基因組時(shí)，有效地減少插入位點(diǎn)附近調(diào)控元件對(duì)hLF表達(dá)的影響。但是，pBC1載體中沒有提供信號(hào)肽序列，為保證hLF能夠順利地分泌到轉(zhuǎn)基因奶山羊的乳汁中，本研究中的 hLF cDNA序列前面自帶了一段長約 57 bp的信號(hào)肽序列。鑒于此載體擁有以上優(yōu)點(diǎn)，可以作為其他外源基因在山羊乳腺中進(jìn)行表達(dá)的通用載體，使用時(shí)只需將目的基因把hLF基因替換掉即可。

將構(gòu)建好的載體 pBC1-hLF-Neo分別轉(zhuǎn)染到了山羊乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺上皮細(xì)胞系中，篩選分別得到了具有藥物抗性的細(xì)胞克隆，使用引物P7/P8、P9/P10對(duì)藥物抗性的細(xì)胞克隆進(jìn)行 PCR鑒定，結(jié)果證明hLF及其轉(zhuǎn)錄表達(dá)盒已經(jīng)成功地整合到了乳腺細(xì)胞的基因組中。由于本試驗(yàn)的目的是驗(yàn)證表達(dá)載體在乳腺細(xì)胞中的表達(dá)情況，而不是為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物提供核供體細(xì)胞，所以不需要對(duì)單個(gè)G418抗性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，而是直接將單獨(dú)一種乳腺細(xì)胞經(jīng)過藥物篩選得到的抗性克隆集中在一起擴(kuò)大培養(yǎng)，這樣做既縮短了擴(kuò)大培養(yǎng)的周期又保證了轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的純度。

乳腺上皮細(xì)胞合成乳蛋白需要合適的激素誘導(dǎo)，影響乳腺上皮細(xì)胞泌乳的激素種類很多，但主要是催乳素、腎上腺糖皮質(zhì)激素及胰島素這3種激素[17]，激素通過特異性受體識(shí)別與胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)來調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。為了鑒定目的基因hLF在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中的表達(dá)情況，分別在這 2種細(xì)胞培養(yǎng)液中添加了胰島素、催乳素、氫化可的松，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)24、48、72 h后，收集培養(yǎng)液上清，使用RT-PCR和Western blotting檢測了hLF基因mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果證明兩種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞所合成的hLF都可以分泌到細(xì)胞上清中，并且表達(dá)的目的蛋白分子量大小一致，為73 kDa左右，小于hLF標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子量77 kDa；通過抑菌圈試驗(yàn)表明重組hLF具有抑制大腸桿菌生長的作用，說明了重組hLF擁有完整的生物功能區(qū)；曹陽等在小鼠 MA3782細(xì)胞表達(dá)了分子量為 34 kDa的重組hLF[18]，Lin等將構(gòu)建的山羊β-酪蛋白為5′端調(diào)控序列表達(dá)載體轉(zhuǎn)入山羊乳腺上皮細(xì)胞中得到了分子量為42 kDa的hLF[14]，都比本研究所獲得的蛋白分子量要?。豢赡茉蚴峭庠茨康幕蛘系郊?xì)胞染色體中時(shí)，由于受到細(xì)胞內(nèi)核酸酶等影響，使得表達(dá)產(chǎn)物在加工、分泌和運(yùn)送到胞外過程中受到影響，有可能導(dǎo)致重組hLF沒有得到正確的折疊或者非折疊區(qū)域被降解從而導(dǎo)致分子量變小。Van Berkel等以牛αS1調(diào)控序列指導(dǎo)hLF在轉(zhuǎn)基因牛體內(nèi)表達(dá)融合蛋白的分子量較標(biāo)準(zhǔn)hLF小1~2 kDa[19]；李寧等以含有完整hLF基因的長度為150 kb左右細(xì)菌人工染色體 (BAC) 作為載體在轉(zhuǎn)基因牛體內(nèi)生產(chǎn)了重組hLF，分子量較標(biāo)準(zhǔn)hLF小1~2 kDa左右[20]。這些結(jié)果均與本試驗(yàn)研究相似，研究表明重組蛋白的糖基化過程是受宿主和表達(dá)位點(diǎn)共同決定的，重組糖基化蛋白實(shí)際分子量大小隨著宿主個(gè)體不同而有所差別[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)小鼠乳腺上皮細(xì)胞 C127和正常山羊乳腺上皮細(xì)胞GMC相比，在hLF基因mRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)及蛋白翻譯后的修飾過程沒有差異; 因山羊原代乳腺上皮細(xì)胞制備過程繁瑣，乳腺細(xì)胞體外分化培養(yǎng)的難度大、表達(dá)效果受到體外培養(yǎng)的各種不確定因素的影響；而使用小鼠乳腺上皮細(xì)胞C127則可克服這一缺點(diǎn)，能夠避免每次試驗(yàn)培養(yǎng)原代細(xì)胞的麻煩，從而消除因細(xì)胞問題引起的試驗(yàn)誤差，使試驗(yàn)結(jié)果一致。

總之，本研究證明了所構(gòu)建的乳腺特異性表達(dá)載體 pBC1-hLF-Neo的結(jié)構(gòu)完全正確，具有完整的生物活性，可以有效地在山羊乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺上皮細(xì)胞表達(dá)和分泌 hLF；此外，本試驗(yàn)證明了C127細(xì)胞和GMC細(xì)胞在檢測hLF基因表達(dá)方面沒有差異，可以用于驗(yàn)證外源基因的乳腺特異性表達(dá)載體在乳腺細(xì)胞中表達(dá)情況。

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Li Meng1, Yanli Zhang1, Xin Xu1, Ziyu Wang1, Yibo Yan1, Xunsheng Pang1, Bushuai Zhong1,Rong Huang1, Yang Song1, Jinyu Wang2, and Feng Wang1
1 Center of Animal Embryo Engineering and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
2 College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China

Received: June 3, 2010; Accepted: September 25, 2010

Supported by: National Science Fund for Distinguished Young Scholars (No. 20625619), Research Program of State Key Laboratory of Food Science and Technology (No. SKLF-MB-200802), National Basic Research Development Program of China (973 Program) (No. 2007CB 714036).

Corresponding author: Jing Wu. Tel: +86-510-85327802; Fax: +86-510-85326653; E-mail: jingwu80@hotmail.com

國家杰出青年基金 (No. 20625619)，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室科研基金 (No. SKLF-MB-200802)，國家重點(diǎn)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃)(No. 2007CB 714036) 資助。