楊瑜，張曉燕,2

1 上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508

2 復旦大學生物醫(yī)學研究院，上海 201508

人體黏膜活組織模型在HIV-1性傳播途徑感染中的應用

楊瑜1，張曉燕1,2

1 上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508

2 復旦大學生物醫(yī)學研究院，上海 201508

性傳播途徑已經成為全球人免疫缺陷病毒1型 (Human immunodeficiency virus type 1，HIV-1) 傳播的主要方式。對HIV-1黏膜感染機制的深入理解，將有助于研發(fā)新型有效的生物技術阻斷其感染和傳播。目前，HIV-1黏膜感染機制的研究主要依賴于體外細胞培養(yǎng)和靈長類動物模型。近年來，一種新型黏膜活組織模型 (包括人體生殖道或腸道黏膜等組織) 的建立，可再現HIV-1突破黏膜屏障進入基底側的生物學過程，適用于 HIV-1黏膜感染機制與黏膜局部感染阻斷生物技術的臨床前有效性評價研究。以下主要闡述了該模型的組織類型、技術特點以及在 HIV-1性途徑感染機制與阻斷技術研究中的進展，并結合本實驗室工作對其新的應用進行了展望。

人免疫缺陷病毒1型，性傳播，組織培養(yǎng)，模型應用

Abstract:Sexual transmission has become the major route of acquiring human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) globally.Understanding the mechanism of HIV-1 mucosal infection will be helpful for development of new effective strategies to block HIV-1 mucosal transmission. Currently, study of the mechanism of HIV-1 mucosal infection majorly depends on in vitro cell culture systems and non-human primate animal models. Recently, a novel tissue explant model (including human vaginal-genital and colorectal tissue) was established, which could elucidate the biological process of HIV-1 mucosal infection from crossing over the membrane to reaching the basal. Therefore, the model can be applied to the study of mechanism, as well as the safety and efficacy evaluation in pre-clinical study of biomedical prevention strategies. In this review, we summarized the recent progress about human mucosal explants model including the sources of tissues, technical characteristics and their application to study the mechanism of HIV-1 sexual transmission and evaluation of prevention strategies. Based on our recent study results, we also provided our opinions aboutdevelopment of novel explant models and their application.

Keywords:human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1), sexual transmission, mucosal infection, explants culture model

在全世界范圍內有將近一半的 HIV-1感染者是婦女，她們大多通過異性性接觸而感染HIV-1[1]；另一方面經同性性接觸而感染 HIV-1的男男同性戀人群 (Men who have sex with men，MSM) 的比例近年來也在迅速地增長[2]；總體來看，經性接觸傳播已經成為全球HIV-1疫情難以控制的主要原因。我國HIV-1新發(fā)感染上升的趨勢依然難以遏制。2007年新發(fā)感染者中56.9%為經性途徑感染，2009年已經上升為70%，性傳播已成為我國HIV-1感染與傳播的主要途徑，促使HIV-1從高危人群向一般人群擴散[3]。

黏膜感染 HIV-1過程中包括生殖道途徑和直腸途徑，研究表明病毒從生殖道部位侵襲到建立系統(tǒng)感染一般需要3~4 d的時間[4]。而相關的病毒侵入與感染黏膜的機制都存在很多不明之處：例如 HIV-1病毒是以游離病毒還是以細胞內病毒的形式感染宿主黏膜細胞？病毒是如何穿越宿主的黏膜屏障進入黏膜下組織？病毒在黏膜感染的初始靶細胞是什么？HIV-1進入黏膜后，黏膜的早期免疫反應是抑制病毒還是給病毒更多機會增殖？從HIV-1進入生殖道或直腸到建立系統(tǒng)的全身感染，有哪些宿主的細胞以及因子與之相互作用？哪些時點和分子可以成為新的生物預防技術的靶點？上述疑惑嚴重制約了有效的 HIV-1黏膜生物預防技術包括疫苗和殺微生物劑的研究。

早期的感染機制研究，多采用體外細胞培養(yǎng)和靈長類動物模型研究。感染 SHIV嵌合病毒的非人靈長類動物模型可很好再現 HIV-1宿主感染的生物學過程，但是動物的購買費用昂貴且感染實驗需在大動物生物安全三級實驗室開展，難以廣泛應用。在細胞水平，體外HIV-1感染多采用可永生傳代的細胞系 (Caco2、Jurkat細胞等)，與正常人體細胞有較大差異；而人PBMC則需要外源激活劑 (PHA等)來維持HIV-1在其中的復制，也明顯改變了細胞表面分子的標記，加之細胞種類單一，都不足以模擬正常黏膜中的靶細胞及其所處的微環(huán)境。因此，有關HIV-1黏膜感染的機制研究，以及對近年來應用于局部阻斷或抑制HIV-1感染的殺微生物劑等預防手段的安全性和有效性評價一直缺乏經濟有效的模型。

為深入探索HIV-1黏膜侵入與感染的機制，研究人員近年來嘗試建立了一種新型的人體活組織體外培養(yǎng)模型。其組織來源可來自女性生殖道或者男性生殖器組織、口腔黏膜以及結直腸黏膜組織。本文將就上述活組織體外培養(yǎng)模型的特點以及在HIV-1性傳播途徑感染研究中的應用加以綜述。

1 活組織培養(yǎng)的起源

組織培養(yǎng)是指組織在體外條件下的存活或生長。動物組織培養(yǎng)的技術起源于19世紀所應用的若干胚胎學技術。1907年美國胚胎學家Harrison的蛙胚神經管組織實驗成為組織培養(yǎng)真正開始的標志[5]。20世紀50年代，隨著操作技術、培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)基的改進，組織培養(yǎng)技術得到更快的發(fā)展。

組織培養(yǎng)的培養(yǎng)物可以在組織上和功能上保持一定程度的分化，這樣就為實驗生物學提供了既處于一定的組織結構之中又脫離了體內種種復雜因素的細胞群體。但在經典的組織培養(yǎng)技術中，由于細胞常常從培養(yǎng)物中向外遷移，因此培養(yǎng)物很快便失去了它們的組織分化特性。后來采用把組織放置在細胞難以粘附的表面上，減少支持物與組織的接觸面積，以及把組織包埋于瓊脂中等方法，大大減少了細胞遷移現象，從而達到限制生長，使器官專一細胞同它們的基質細胞維持相對正常的結構關系的目的。

2 模型應用的組織類型與來源

HIV-1黏膜感染主要涉及的組織類型有子宮頸陰道[6]、包皮[7]和直腸乙狀結腸[8]等。按組織的結構特點可分為單層柱狀上皮類 (結直腸、子宮頸內膜等) 與復層鱗狀上皮類 (陰道、子宮頸外膜、包皮等)，組織的不同結構特點決定了HIV-1進入機制的差異，例如專屬于單層柱狀上皮細胞的胞轉作用等。

子宮頸陰道組織多來自絕經期前婦女的子宮切除術或陰道修補術后的標本[9]；子宮切除術常見于子宮多發(fā)性肌瘤，而陰道修補術因屬整形類手術，受地域、經濟因素影響大，目前國內開展較少。

直腸乙狀結腸組織有幾種來源：活檢組織、腫瘤患者癌旁組織以及直腸脫垂患者組織?；顧z標本可通過內窺鏡直視，獲取特異部位的黏膜組織，但活檢機械手臂咬合組織時容易傷及黏膜表面，而且總量較少，一個患者最多可獲20塊活檢組織[10]，相較而言腫瘤患者和直腸脫垂患者手術后獲得的黏膜組織面積大，可滿足較多需求，提高了實驗設計的靈活性，是目前較為常用的組織來源。

包皮組織絕大多數是因包皮過長進行的環(huán)切手術獲得，一般患者年齡偏低 (青少年)，極少合并其他重大疾病，是上述各類組織來源中最接近體內正常組織生理狀態(tài)的一種。

3 HIV-1黏膜感染模型培養(yǎng)技術特點

活組織培養(yǎng)的方式，有的是直接將組織標本塊修剪，進行培養(yǎng)，其培養(yǎng)技術包括支撐筏 (Rafts)、Transwell等[10-11]；也有的是用消散的細胞進行組織重建，構成黏膜的片層，再現上皮細胞的特征。

3.1 活組織整體培養(yǎng)

目前國際上有幾家實驗室相繼開展了人體活組織培養(yǎng)在 HIV-1感染中的應用研究。他們基于前人發(fā)展的組織培養(yǎng)技術，結合HIV-1性途徑感染特點，研究建立HIV-1感染相關的黏膜組織模型。1992年，Fleming等為確認HIV-1能否直接感染人腸道黏膜而不是腸道細胞系，將胎兒腸黏膜剪切成塊 (2 mm3)放入培養(yǎng)基進行了培養(yǎng)及感染實驗，這是較為早期的涉及黏膜體外培養(yǎng)進行HIV-1感染的嘗試[12]。

3.1.1 支撐筏模型 (Rafts)

Shattock等將宮頸活檢組織鉆取成3 mm或8 mm直徑大小，黏膜面向上置于24板內的方形不銹鋼網支架上，加入培養(yǎng)基使其圍繞支架形成新月形的氣-液界面，讓黏膜表面暴露于空氣，而其底部則可透過不銹鋼網格孔與培養(yǎng)基接觸從而保證汲取營養(yǎng)。其后，人們試用各種材質的支撐物對黏膜進行培養(yǎng)[11]，如濾紙、Millipore濾膜、吸收性明膠海綿等，最終認為吸收性明膠海綿效果更有利于組織存活 (圖 1A)[10]。

3.1.2 Transwell類模型

該類模型依據Transwell小室建立，其外形為一個可放置在孔板里的小杯子，并采用通透性濾膜作杯底。Collins等[13]的模型中，將人宮頸復層鱗狀上皮組織黏膜面向上放入上室濾膜，用瓊脂糖凝膠灌注封閉黏膜四周，讓病毒只能接觸中心未封閉的黏膜表面 (圖1B)。Cummins等[14]發(fā)展的組織極化模型不同之處是將Transwell上室濾膜鉆孔，組織塊從孔中穿越，把黏膜層露在上室而基底部跨過濾膜浸入下室培養(yǎng)基中 (圖1C)。兩種模型異曲同工，都是只把黏膜面暴露于可接觸病毒的環(huán)境，近似的模擬生理狀態(tài)下HIV-1在女性生殖道內感染的過程。但在實際操作中也暴露出一些問題，如本實驗室曾用該類模型，發(fā)現在安全柜中操作時無法垂直注視小室，向其中灌注凝膠時用量較難把握：凝膠過多會將黏膜面一起封閉，少則封閉不嚴發(fā)生病毒泄漏；而Shen等[15]的模型則逆向思維，解決了這一問題 (圖1D)：他們將黏膜組織切成1 cm2大小，放入鋪有尼龍濾網的上室中，在黏膜面上放置一個直徑0.6 cm、高1 cm的聚丙烯小桶作為感染用“上室”，然后用外科膠將小桶四周的黏膜面及暴露組織全部封閉，這樣可灌注足夠量的凝膠而不必擔心黏膜面被覆蓋。在感染實驗中相比兩類方法可以看到，前者的黏膜用

圖1 組織整體培養(yǎng)模型：Rafts模型 (A)[10]和Transwell模型 (B，C，D)[13-15]Fig. 1 The models of whole tissue culture: Rafts model (A) and Transwell models (B, C, D).

量較小，但對凝膠封閉操作技術要求高，且封閉后各實驗孔間暴露的黏膜面積難以保持均一，這有可能導致不同實驗孔的病毒因接觸的黏膜面積及靶細胞的數量不同而對實驗結果的統(tǒng)計產生影響；后者應用直徑統(tǒng)一的聚丙烯小桶作為上室，保證了黏膜與病毒的接觸面積相同，同時該做法使凝膠封閉也易于操作，不足之處是模型中每個實驗孔對完整的組織黏膜用量都提高了近2~3倍，在一定程度上限制了實驗規(guī)模。

3.2 活組織片層或細胞重建組織層培養(yǎng)

黏膜感染 HIV-1后，上皮層內的粒細胞和郎格罕氏細胞 (Langerhans cells，LCs) 短時即可遷移出來，檢測培養(yǎng)基中遷移細胞可以觀察HIV-1的感染率，但活組織的整體培養(yǎng)無法確認細胞來源于上皮層還是基質層？因此，McElrath教授的課題組采用一種體外器官活組織片層培養(yǎng)技術[9]，利用真空負壓吸引或EDTA低溫處理過夜的方法較為溫和的分離上皮層與基質層，能保持上皮層的完整結構和活力。也有的采用消散的細胞或細胞系進行組織重建，構成黏膜的片層，再現上皮細胞的特征。如Bouschbacher等[16]即利用人原代成纖維細胞和陰道上皮細胞共同重構陰道黏膜層，特異性觀察整合進去的LCs在HIV-1感染中的作用，避免了T細胞和巨噬細胞的“干擾”。Nazli等[17]將原代女性生殖道上皮細胞等建成緊密的單細胞層，以此驗證 HIV-1感染對黏膜屏障的損傷作用。此類模型雖然將組織微環(huán)境趨于簡單化，與體內復雜環(huán)境有一定差異，卻更有利于觀察特定區(qū)域或特定細胞在HIV-1感染前后的變化。

4 在機制研究和生物預防技術評價中的應用

4.1 黏膜感染機制研究

HIV-1侵入完整黏膜的途徑包括：通過LCs、樹突狀細胞 (Dendritic cells，DCs)、M細胞 (Microfold cell) 等的捕捉式跨上皮運輸方式[18-19]，或經與上皮細胞的半乳糖神經酰胺 (Galactosyl ceramide) 等受體結合被轉運穿越上皮細胞層[20]。穿越黏膜的病毒可直接感染固有層的 CD4+T細胞，或與表達DC-SIGN受體的DCs結合，通過順式感染或反式感染的方式進行傳播：即一種方式是在DCs中建立感染進行復制，并利用產生的子代病毒感染CD4+T等靶細胞；另一種方式則以DCs為載體被直接運載去感染CD4+T細胞[21]。

以上機制研究多采用動物或細胞模型。與這些模型相比，組織模型的一個優(yōu)勢是可在HIV-1急性感染期進行多點連續(xù)采樣進行免疫組化、流式細胞術、電鏡等損傷性檢測，對HIV-1進入黏膜的生物學軌跡進行跟蹤研究，同時又不失其在體內復雜的組織結構。對于病毒進入的時間，采用人的宮頸陰道活組織培養(yǎng)體系觀察HIV-1初始感染期的研究顯示[22]，HIV-1臨床分離病毒株接種3~4 d，在宮頸黏膜下層出現許多感染細胞，4~6 d后在組織檢測到感染的白細胞。而感染損傷的組織，則最早 3 d即可檢測到感染的白細胞。Gupta小組的研究則進一步顯示宮頸組織感染后6 h黏膜下層即可檢測到HIV-1陽性細胞，并確認為記憶性 CD4+T細胞；96 h后HIV-1陽性LCs與巨噬細胞才被檢測到[23]。

在生殖道，通過活組織片層的感染研究發(fā)現，HIV-1一旦接觸局部黏膜可迅速滲透上皮內LCs 和CD4+T細胞。HIV-1進入CD4+T細胞幾乎完全是由CD4和CCR5 受體介導的直接融合方式，無需LCs細胞傳遞病毒。而HIV-1進入CD1a+ LCs 細胞則主要通過細胞內吞 (Endocytosis) 作用，借助于多種受體[9]。在Saba等的宮頸陰道組織模型研究中，感染的T細胞均為表達CCR5的效應記憶T細胞。盡管有廣泛表達CXCR4受體，但絕大多數組織仍只支持CCR5嗜性HIV-1病毒的復制[24]，當單獨阻斷CD4或同時阻斷CXCR4與CCR5受體時可局部抑制病毒的黏膜感染[25]。此外，支持 CXCR4嗜性病毒復制的組織擁有一個共同特征——富含 CD27+CD28+效應記憶T細胞[24]。

進入黏膜后的病毒如欲進一步傳播，離不開組織中細胞的遷移作用，同時阻斷 CD4與 DC-SIGN可抑制遷移細胞對HIV-1的攝取與傳播。流式分析與免疫染色遷移細胞時發(fā)現兩群細胞：CD3+HLA-DR-和CD3-HLA-DR+細胞，后者顯著表達DC-SIGN。研究顯示這些HLA-DR+細胞90%與HIV傳播相關[25]。

在對宮頸與包皮組織中免疫細胞進行比較研究時，Petterson等[26]發(fā)現成人包皮黏膜中 CD4+T細胞、巨噬細胞、郎罕氏細胞的比例分別達 22.4%、2.4%和11.5%，遠高于兒童包皮組織 (4.9%、0.3%、6.2%) 和婦女的宮頸組織 (6.2%、1.4%、1.5%)。與宮頸黏膜或包皮的外表面組織相比，包皮內側黏膜對HIV-1 BaL (R5嗜性) 有顯著的易感性。此外，外源的刺激可改變組織中細胞表面蛋白的表達、TNF-α處理可將靜息LCs激活，這些都只發(fā)生在內側包皮而非外側包皮[27]，這部分解釋了為什么包皮環(huán)切術可以降低人群中HIV-1的感染率[28-29]。

近年來，由于MSM人群HIV-1感染顯著上升，腸道黏膜在HIV-1傳播與病理中扮演的作用日益受到重視。但是關于腸道黏膜HIV-1感染的機制缺乏深入的研究。生殖道黏膜與腸道黏膜的生理結構、組織細胞構成以及微生態(tài)環(huán)境均存在很大的差異性。例如同樣的巨噬細胞在生殖道和腸道中對HIV-1感染易感性也存在很大的差異性。有報告稱陰道和腸道的巨噬細胞表達不同水平的免疫受體及 HIV-1受體CD4與輔助受體CCR5、CXCR4。病毒穿越黏膜上皮后，是陰道而不是腸道巨噬細胞允許 R5 HIV-1復制[30]。HIV-1腸道黏膜感染的機制包括首感細胞與遷徙軌跡則存在更多亟待探索的問題。

4.2 評價生物預防技術的安全性與有效性

評價殺微生物劑的安全性與有效性也是上述人體黏膜活組織模型最初建立的目的之一[10,13]。由于第一個進入臨床試驗的抗HIV-1廣譜殺微生物劑——壬苯醇醚 (Nonoxynol-9，N-9)，沒有顯示出預期的保護效果，通過兔子陰道模型人們發(fā)現，臨床劑量的N-9對黏膜有較大的毒性損傷，破壞上皮屏障，誘導炎癥產生，從而導致HIV-1感染率不降反升[31]。因此在用組織模型進行殺微生物劑評價之初，常用N-9作為對照，以觀測黏膜對藥物毒性的靈敏度。由于陰道與腸道組織的差異性，陰道用殺微生物劑能否安全有效的用于腸道需要重新進行評估。在Fletcher等[10]的結直腸模型中，評價的6種殺微生物劑在1 mg/mL的最高劑量時均沒有顯示出對組織的毒性作用，與之形成鮮明對照的是，同樣濃度的N-9已讓組織活性降低至69%。其中第1代殺微生物劑(多聚陰離子聚合物) 中的 PRO2000與硫酸糊精(Dextrin sulphate) 分別在陰道用藥劑量的1/5 000和1/40時即可達到99%的保護。第2代殺微生物劑 (逆轉錄酶抑制劑) 中 PMPA (9-[2-(phosphonomethoxy)peopyl]adenine) 可有效抑制病毒的劑量也只有陰道制劑的 1%。同時在宮頸、包皮等組織上的驗證，也顯示出PRO2000等殺微生物劑在安全劑量范圍內具有病毒抑制效果[7,32-33]。

由于組織模型感染無法像細胞模型那樣控制病毒的靶細胞數量，病毒在其中的復制生長受到組織類型、培養(yǎng)方式、病毒接種等眾多因素的影響，這將影響對殺微生物劑評價結果的可重復性與可信度，實驗室之間的結果也難以比較。為此，Richardson-Harman等[34]報道了一種較為客觀檢測病毒生長狀況及評價候選殺微生物劑的軟終點法 (Soft-endpoint)。病毒生長曲線可分為 4個階段：停滯期、指數增長期、穩(wěn)定期和衰退期。軟終點法是指無論病毒復制水平高低，都將其在組織內生長的穩(wěn)定期作為時間截取點進行 p24等檢測與統(tǒng)計，這樣便于分析和比較不同實驗室得到殺微生物劑臨床前比較的實驗結果，減少固有偏差。利用該方法判斷病毒在直腸組織模型中生長的變異性最大。同時在該方法中病毒原始株及其進化分支是影響病毒復制的關鍵參數，雖然組織類型與模型差異也是影響病毒復制的非常重要的參數，但若使用同一類型組織時，實驗室間仍可以用p24水平及IC50來進行可靠的藥效比較。

5 本實驗室的活組織培養(yǎng)進展

本實驗室已開展了包括結、直腸、包皮等組織來源的Rafts和Transwell培養(yǎng)模型。通過Rafts模型在對腸道黏膜的培養(yǎng)中，HE染色觀察第5天組織結構依然良好，13 d時黏膜結構依然可見。經MTT法檢測培養(yǎng)10 d內的組織活性，顯示培養(yǎng)4 d時組織活性高于80%，7 d的活性可保持在50%左右，包皮培養(yǎng)存活狀態(tài)優(yōu)于腸道黏膜，與其他實驗室相比，本實驗對腸道組織與包皮組織的培養(yǎng)無論組織結構的完整性保持或高活性的培養(yǎng)時間均優(yōu)于已有的報道[7,10]，建立的組織模型可以滿足后續(xù)的實驗要求。

藥物的臨床前安全性與有效性評價首先要求評價模型具有一定的敏感性，本實驗室用10倍濃度梯度的N-9分別與結腸黏膜孵育，發(fā)現黏膜活性隨N-9濃度的升高而降低，即使將梯度差減小至3倍，黏膜依然可以靈敏地反映出藥物的毒性變化。此外，對臨床試驗中證明安全的幾種抗HIV-1 藥物進行平行觀察，對組織活性的影響較小，而對照N-9組活性明顯降低。

6 展望

人體組織培養(yǎng)模型中的組織塊是在脫離了機體的情況下獨立生存，因此得出的研究結果還不能與人體感染的真實情況完全等同，這點需要在數據分析中予以注意。同時，組織培養(yǎng)模型還存在著一些爭議和需要解決的問題，例如，組織來源的背景資料、抗生素等對組織激素水平的影響、靶細胞數量、結果的分析等[35-37]。但不可否認的是，組織培養(yǎng)模型，尤其是人體組織來源的模型在 HIV-1性途徑感染的研究中具有不可替代的優(yōu)勢。

未來，模型的構建和應用仍有較大的拓展空間。首先，隨著研究目的不同，組織來源將不局限于現有類型。其次，現有組織培養(yǎng)技術可進一步完善，如借鑒臨床外科的器官移植取材規(guī)范與體外保存技術，以及對培養(yǎng)基成分的優(yōu)化調整，都將對改善組織存活狀態(tài)有較大幫助。從本實驗室的經驗來看，使用器官移植保存液作為組織離體后的運輸液能更好的保持黏膜狀態(tài)；在機制研究中，可向模型中加入人體微環(huán)境存在的介質或采用不同類型組織共同培養(yǎng)等方式以進一步模擬真實感染環(huán)境；第三，新的應用開發(fā)。將一些細胞或動物模型上難以培養(yǎng)的病毒用人體組織模型進行培養(yǎng) (例如丙肝病毒等)，從艾滋病研究延伸到性傳播疾病等更廣泛的領域。在感染靶細胞間或受體間相互作用機制、局部免疫與炎癥等研究以及公共衛(wèi)生突發(fā)傳染病病原體的快速鑒定上進行突破。組織水平的安全性與有效性評價范圍也可擴展涵蓋至抗病毒藥物以外的更多的生物預防性策略 (如疫苗等)，這些也將作為我們今后考慮的研究方向。

REFERENCES

[1] Quinn TC, Overbaugh J. HIV/AIDS in women: an expanding epidemic. Science, 2005, 308(5728):1582?1583.

[2] Beyrer C. Global prevention of HIV infection for neglected populations: men who have sex with men. Clin Infect Dis, 2010, 50(Suppl 3): S108?113.

[3] The Ministry of Health of the People's Republic of China,2009 Update on the HIV/AIDS Epidemic in China.2009-12-02. http://www.moh.gov.cn.

[4] Miller CJ, Li Q, Abel K, et al. Propagation and dissemination of infection after vaginal transmission of simian immunodeficiency virus. J Virol, 2005, 79(14):9217?9227.

[5] Harrison RG, Greenman MJ, Mall FP, et al. Observation on the living developing nerve fiber. Anat Rec, 1907, 1(5):116?128.

[6] Wallace GS, Cheng-Mayer C, Schito ML, et al. Human immunodeficiency virus type 1 nucleocapsid inhibitors impede transinfection in cellular and explant models and protect nonhuman primates from infection. J Virol, 2009,83(18): 9175?9182.

[7] Fischetti L, Barry SM, Hope TJ, et al. HIV-1 infection of human penile explant tissue and protection by candidate microbicides. Aids, 2009, 23(3): 319?328.

[8] Herrera C, Cranage M, McGowan I, et al. Reverse transcriptase inhibitors as potential colorectal microbicides. Antimicrob Agents Chemother, 2009, 53(5):1797?1807.

[9] Hladik F, Sakchalathorn P, Ballweber L, et al. Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1. Immunity, 2007,26(2): 257?270.

[10] Fletcher PS, Elliott J, Grivel JC, et al. Ex vivo culture of human colorectal tissue for the evaluation of candidate microbicides. AIDS, 2006, 20(9): 1237?1245.

[11] Grivel JC, Margolis L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nat Protoc, 2009, 4(2):256?269.

[12] Fleming SC, Kapembwa MS, MacDonald TT, et al. Direct in vitro infection of human intestine with HIV-1. AIDS,1992, 6(10): 1099?1104.

[13] Collins KB, Patterson BK, Naus GJ, et al. Development of an in vitro organ culture model to study transmission of HIV-1 in the female genital tract. Nat Med, 2000, 6(4):475?479.

[14] Cummins JE Jr, Guarner J, Flowers L, et al. Preclinical testing of candidate topical microbicides for anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and tissue toxicity in a human cervical explant culture. Antimicrob Agents Chemother, 2007, 51(5): 1770?1779.

[15] Shen R, Drelichman ER, Bimczok D, et al. GP41-specific antibody blocks cell-free HIV type 1 transcytosis through human rectal mucosa and model colonic epithelium. J Immunol, 2010, 184(7): 3648?3655.

[16] Bouschbacher M, Bomsel M, Verronese E, et al. Early events in HIV transmission through a human reconstructed vaginal mucosa. Aids, 2008, 22(11): 1257?1266.

[17] Nazli A, Chan O, Dobson-Belaire WN, et al. Exposure to HIV-1 directly impairs mucosal epithelial barrier integrity allowing microbial translocation. PLoS Pathog, 2010,6(4): e1000852.

[18] Sivard P, Berlier W, Picard B, et al. HIV-1 infection of Langerhans cells in a reconstructed vaginal mucosa. J Infect Dis, 2004, 190(2): 227?235.

[19] Amerongen HM, Weltzin R, Farnet CM, et al.Transepithelial transport of HIV-1 by intestinal M cells: a mechanism for transmission of AIDS. J Acquir Immune Defic Syndr, 1991, 4(8): 760?765.

[20] Sa?di H, Magri G, Nasreddine N, et al. R5- and X4-HIV-1 use differentially the endometrial epithelial cells HEC-1A to ensure their own spread: Implication for mechanisms of sexual transmission. Virology, 2007, 358(1): 55?68.

[21] Kwon DS, Gregorio G, Bitton N, et al. DC-SIGN-mediated internalization of HIV is required for trans-enhancement of T cell infection. Immunity, 2002, 16(1): 135?144.

[22] Maher D, Wu X, Schacker T, et al. HIV binding,penetration, and primary infection in human cervicovaginal tissue. Proc Natl Acad Sci USA, 2005,102(32): 11504?11509.

[23] Gupta P, Collins KB, Ratner D, et al. Memory CD4(+) T cells are the earliest detectable human immunodeficiencyvirus type 1 (HIV-1)-infected cells in the female genital mucosal tissue during HIV-1 transmission in an organ culture system. J Virol, 2002, 76(19): 9868?9876.

[24] Saba E, Grivel JC, Vanpouille C, et al. HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model.Mucosal Immunol, 2010, 3(3): 280?290.

[25] Hu Q, Frank I, Williams V, et al. Blockade of attachment and fusion receptors inhibits HIV-1 infection of human cervical tissue. J Exp Med, 2004, 199(8): 1065?1075.

[26] Patterson BK, Landay A, Siegel JN, et al. Susceptibility to human immunodeficiency virus-1 infection of human foreskin and cervical tissue grown in explant culture. Am J Pathol, 2002, 161(3): 867?873.

[27] Fahrbach KM, Barry SM, Anderson MR, et al. Enhanced cellular responses and environmental sampling within inner foreskin explants: implications for the foreskin's role in HIV transmission Mucosal Immunol, 2010, 3(4):410?418.

[28] Bailey RC, Moses S, Parker CB, et al. Male circumcision for HIV prevention in young men in Kisumu, Kenya: a randomised controlled trial. Lancet, 2007, 369(9562):643?656.

[29] Gray RH, Kigozi G, Serwadda D, et al. Male circumcision for HIV prevention in men in Rakai, Uganda: a randomised trial. Lancet, 2007, 369(9562): 657?666.

[30] Shen R, Richter HE, Clements RH, Novak L, et al.Macrophages in vaginal but not intestinal mucosa are monocyte-like and permissive to human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol, 2009, 83(7): 3258?3267.

[31] Hillier SL, Moench T, Shattock R, et al. In vitro and in vivo: the story of nonoxynol 9. J Acquir Immune Defic Syndr, 2005, 39(1): 1?8.

[32] Rohan LC, Moncla BJ, Kunjara Na Ayudhya RP, et al. In vitro and ex vivo testing of tenofovir shows it is effective as an HIV-1 microbicide. PLoS One, 2010, 5(2): e9310.

[33] Greenhead P, Hayes P, Watts PS, et al. Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides. J Virol,2000, 74(12): 5577?5586.

[34] Richardson-Harman N, Lackman-Smith C, Fletcher PS, et al. Multisite comparison of anti-human immunodeficiency virus microbicide activity in explant assays using a novel endpoint analysis. J Clin Microbiol, 2009, 47(11):3530?3539.

[35] Shattock RJ, Griffin GE. Gorodeski GI. In vitro models of mucosal HIV transmission. Nat Med, 2000, 6(6):607?608.

[36] Gupta P, Collins K, Patterson B, et al. Reply to 'In vitro models of mucosal HIV transmission. Nat Med, 2000,6(6): 607?608.

[37] Anderson DJ, Pudney J, Schust DJ. Caveats associated with the use of human cervical tissue for HIV and microbicide research. AIDS, 2010, 24(1): 1?4.

[15] Khromykh AA, Sedlak PL, Westaway EG. Cis- and trans-acting elements in flavivirus RNA replication. J Virol, 2000, 74(7): 3253?3263.

[16] Pijlman GP, Suhrbier A, Khromykh AA. Kunjin virus replicons: an RNA-based, non-cytopathic viral vector system for protein production, vaccine and gene therapy applications. Expert Opin Biol Ther, 2006, 6(2): 135?145.

[17] Varnavski AN, Khromykh AA. Noncytopathic flavivirus replicon RNA-based system for expression and delivery of heterologous genes. Virology, 1999, 255(2): 366?375.

[18] Anraku I, Harvey TJ, Linedale R, et al. Kunjin virus replicon vaccine vectors induce protective CD8+T-cell immunity. J Virol, 2002, 76(8): 3791?3799.

[19] Harvey TJ, Anraku I, Linedale R, et al. Kunjin virus replicon vectors for human immunodeficiency virus vaccine development. J Virol, 2003, 77(14): 7796?7803.

[20] Anraku I, Mokhonov VV, Rattanasena P, et al. Kunjin replicon-based simian immunodeficiency virus gag vaccines. Vaccine, 2008, 26(26): 3268?3276.

[21] Kent SJ, Rose RD, Mokhonov VV, et al. Evaluation of recombinant Kunjin replicon SIV vaccines for protective efficacy in macaques. Virology, 2008, 374(2): 528?534.

[22] Hoang LD, Anraku1 I, Wang XJ, et al. A Kunjun replicon vector encoding granulocyte macrophage colony-stimulating factor for intra-tumoral gene therapy. Gene Ther, 2009,16(2): 190?199.

Application of human mucosal explants culture in the HIV-1 sexual transmission

Yu Yang1, and Xiaoyan Zhang1,2
1 Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University, Shanghai 201508, China
2 Institutes of Biomedical Sciences, Fudan University, Shanghai 201508, China

Received: May 11, 2010; Accepted: June 25, 2010

Supported by: Natural Science Foundation of Department of Education of Anhui Province (No. KJ2008A127), Start-up Foundation for Doctor. of Anhui University. (No. 02203105).

Corresponding author: Honghua Ge. Tel: +86-551-5107224; Fax: +86-551-5107240; E-mail: hhge@ustc.edu

安徽省教育廳自然基金重點項目 (No. KJ2008A127)，安徽大學博士啟動基金項目 (No. 02203105) 資助。