葛宏華，武赟，肖亞中

安徽大學(xué)現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心&生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230039

漆酶空間結(jié)構(gòu)、反應(yīng)機(jī)理及應(yīng)用

葛宏華，武赟，肖亞中

安徽大學(xué)現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心&生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230039

漆酶 (EC 1.10.3.2) 屬于多銅氧化酶家族，可以催化氧化酚類和芳香類化合物，利用自由基反應(yīng)機(jī)理完成4個電子的轉(zhuǎn)移，并將分子氧還原成水。漆酶具有非常保守的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)，結(jié)合作者自身工作實(shí)踐，對漆酶結(jié)構(gòu)與功能的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，其中對漆酶的三維結(jié)構(gòu)、活性中心、催化機(jī)理研究和最新的應(yīng)用進(jìn)展作重點(diǎn)闡述。

多銅氧化酶，漆酶結(jié)構(gòu)，三核中心

Abstract:Laccases (benzenediol: oxygen oxidoreductases; EC 1.10.3.2) are copper-containing polyphenol oxidases that can oxidize a wide range of aromatic compounds, concomitantly with the transfer of four electrons and the reduction of molecular oxygen to water. The progress on the research of laccases structure and function is reviewed. Their three-dimensional structures and catalytic mechanism, as well as their applications in different fields are emphasized.

Keywords:multicopper oxidases, laccase structure, trinuclear cluster

漆酶 (EC 1.10.3.2) 是一種含銅的多酚氧化酶，是藍(lán)色多銅氧化酶家族 (MCO) 中最主要的成員。它利用銅離子特有的氧化還原能力氧化酚類和芳香類化合物，同時(shí)將分子氧還原成水[1]。在 200多種氧化還原酶當(dāng)中，只有 6類酶可以催化這種有氧的反應(yīng) (細(xì)胞色素氧化酶、漆酶、L-抗壞血酸氧化酶、血漿銅藍(lán)蛋白、膽紅素氧化酶和吩惡嗪合成酶)。

漆酶最初發(fā)現(xiàn)于日本漆樹的汁液中，之后，在各種擔(dān)子菌與子囊菌中均發(fā)現(xiàn)有大量的漆酶存在，真菌漆酶具備多種生理生化功能，如形態(tài)發(fā)生、真菌與植物寄主相互作用、應(yīng)激防御以及木質(zhì)素降解[2]。目前，幾乎所有的白腐真菌中均發(fā)現(xiàn)有漆酶的存在，同時(shí)該酶也廣泛存在于植物、部分細(xì)菌和昆蟲中。植物漆酶與木質(zhì)素的生物合成密切相關(guān)；細(xì)菌漆酶主要參與形態(tài)發(fā)生、芽胞外被抵御紫外與過氧化物的傷害、孢子色素的生物合成和銅離子的體內(nèi)平衡；而昆蟲漆酶蛋白的主要功能是控制表皮的骨化作用[3-4]。

1 漆酶的結(jié)構(gòu)與功能

1.1 一級序列與空間結(jié)構(gòu)

大部分漆酶以胞外單分子球狀蛋白形式存在，其分子量約為60~70 kDa，等電點(diǎn)pI 4.0左右。漆酶分子均有不同程度的糖基化，其含量為10%~25%，也有一些大于30%[5]。每個漆酶分子內(nèi)含有4個銅離子，根據(jù)光譜學(xué)特性可以分成 3類，包括 1個 I型 (T1) 銅離子 (Cu1)、1個 II型 (T2) 和 2個 III型 (T3) 銅離子 (Cu2和Cu3)，其中Cu2和Cu3形成了1個三核中心 (TNC)[6-7]。通過對100多個漆酶的序列比對和分析，發(fā)現(xiàn)有 4個特征性序列區(qū)(L1?L4) 可以用來鑒別漆酶[8](表1)，12個與銅離子結(jié)合的氨基酸殘基均位于這4個保守區(qū)域，其中L2和 L4與之前報(bào)道的 MCO含銅蛋白特征性序列相符，而L1和L3則是漆酶特有的序列區(qū)。此外，根據(jù)目前漆酶已知空間結(jié)構(gòu)的比對，可以鑒定出與底物結(jié)合相關(guān)的 4個loop區(qū) (loop I、II、III、IV) (表2)。相對于特征性序列區(qū)，這些loop區(qū)無論從一級序列還是空間位置及長度都有著較為明顯的不同，導(dǎo)致了各種漆酶擁有不同的底物特異性。例如筆者解析的栓菌Trametes sp. AH28-2的LacB晶體結(jié)構(gòu)(PDB注冊號為3KW7) 具有較長的loop IV，大大延伸了底物結(jié)合區(qū)域，同時(shí)該loop帶有較強(qiáng)的負(fù)電荷，并在漆酶分子表面形成了一個凸起，因此可能對調(diào)節(jié)底物的結(jié)合發(fā)揮著重要作用[9]。

迄今有下列擔(dān)子菌漆酶的三維結(jié)構(gòu)被解析：灰蓋鬼傘Coprinus cinereus的漆酶Lac-Cc (CcL: pdb注冊號 1A65)[10]，變色栓菌 Trametes versicolor 的Lcc I (TvL: 1GYC)[11]和 Lac IIIb (TvL: 1KYA)[12]，木硬孔菌 Rigidoporus lignosus的RlL (R1G: 1V10)[7]，虎皮香菇Lentinus tigrinus的LtL (2QT6)[13]，毛栓菌Trametes trogii的TtL (2HRG)[14]，毛栓菌Trametes hirsuta的ThL (3FPX)[15]以及Trametes sp. AH28-2的LacB (3KW7)[9]。另外，有晶體結(jié)構(gòu)報(bào)道的還有來自子囊菌熱白絲菌 Melanocarpus albomyces的天然漆酶 MaL (1GWO) 及其重組形式蛋白 rMaL(2Q9O)[16-17]、以及個別細(xì)菌漆酶[4]。

表1 漆酶特異性序列Table 1 laccase signature sequences

表2 漆酶的底物結(jié)合loop序列比對Table 2 Structural alignment of substrate binding loops

所有的這些漆酶結(jié)構(gòu)均采用一種相似的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)，以筆者解析的Trametes sp. AH28-2的LacB晶體結(jié)構(gòu)為例 (圖 1) (本文中蛋白結(jié)構(gòu)示意圖均使用 Pymol軟件繪制[18])，整個單體分子由 3個杯狀(Cupredoxin-like) 結(jié)構(gòu)域 (Domain 1、2、3) 組成，每個結(jié)構(gòu)域均有1個希臘花邊 (Greek key) β桶狀結(jié)構(gòu)。Cu1位于domain 3，而TNC則深埋于domain 1和3之間，并與它們的一些保守殘基相互作用。此外，LacB分子內(nèi)還有 2個二硫鍵連接著 domain 1和2以及domain 1和3，但也有些真菌漆酶含有3個二硫鍵，比如MaL[16]。和大部分漆酶一樣，LacB是一個糖蛋白，糖的含量約25%，在預(yù)測的11個糖基化位點(diǎn)中，晶體結(jié)構(gòu)清楚地顯示有 8個位點(diǎn)被不同程度地糖基化[9]。

圖1 Trametes sp. AH28-2的LacB晶體結(jié)構(gòu)立體視圖Fig. 1 Stereo view of Trametes sp. AH28-2 LacB structure.

1.2 Cu1結(jié)合位點(diǎn)及與還原性底物的反應(yīng)

典型的MCO成員一般都有4個氨基酸殘基 (通常有1個Met) 圍繞著Cu1形成了第1個配位球狀體結(jié)構(gòu)[1]，但在漆酶結(jié)構(gòu)中，Cu1與 1個 Cys的硫原子、2個His的氮原子 (Nd1) 組成了1個平面三角配位體結(jié)構(gòu)。Cys的硫和Cu的配位鍵在614 nm處有特征性吸收峰，這也是漆酶呈現(xiàn)藍(lán)色的原因[19]。在漆酶催化反應(yīng)中，底物的4個單電子被轉(zhuǎn)移，而Cu1是初級電子受體位點(diǎn)，之后電子通過高度保守的His-Cys-His轉(zhuǎn)移到TNC三核中心，進(jìn)而傳遞給分子氧使之還原成水[20](圖2A)。Cu1的還原是催化過程的限速反應(yīng)，采取的是Marcus的“outer-sphere”機(jī)理，即Cu1與底物之間氧化還原電勢差ΔE0決定了電子轉(zhuǎn)移速率[21]。Cu1的E0基本上在420~790 mV之間，高于其他的多銅氧化酶[22]，目前普遍認(rèn)為漆酶Cu1位點(diǎn)缺乏第4個配位殘基是造成這種高氧化還原電勢的重要因素。但這些具有相似的Cu1配位體結(jié)構(gòu)的漆酶成員如何呈現(xiàn)出不同的氧化還原電勢還需要進(jìn)一步闡明。

圖2 漆酶活性中心結(jié)構(gòu)示意圖 (A) 及TvL1KYA與2,5-二甲苯胺相互作用立體示意圖 (B)Fig. 2 The structure of the laccase active site (A) and stereo view of the active site of TvL1KYA, which binds substrate 2,5-dimethylaniline (B).

Cu1位點(diǎn)是底物反應(yīng)場，位于漆酶的表面并形成了一個比較大的凹槽，從而能夠?qū)捤傻厝菁{多種底物。結(jié)構(gòu)TvL1KYA (TvL表明漆酶的來源，1KYA表示PDB注冊號，下同) 第一次展示了高分辨率的漆酶與底物2,5-二甲苯胺形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)[12]，結(jié)構(gòu)表明 2,5-二甲苯胺結(jié)合于底物結(jié)合區(qū)域，并于 4個loop上的若干疏水性殘基發(fā)生相互作用 (圖2B)。此外，His458和 Asp206在酶與底物的氨基相互作用中發(fā)揮重要作用，His458與Cu1配位成鍵并在所有MCO中高度保守，其側(cè)鏈咪唑環(huán)與2,5-二甲苯胺上的氮形成氫鍵，這表明在電子傳遞給Cu1過程中，His458起到了一個入口的作用。與此同時(shí)，2,5-二甲苯胺上的氨基與結(jié)合區(qū)域背面的 Asp206的側(cè)鏈氧形成了另一個氫鍵[16]，在擔(dān)子菌的真菌漆酶中，Asp206位點(diǎn)相當(dāng)保守，而來自于子囊菌的漆酶在這個位置則用Glu替代了Asp。Asp與底物的相互作用決定了漆酶的pH依賴性[23]：當(dāng)pH從3上升到5，由于Asp206側(cè)鏈的去質(zhì)子化，使得酚類化合物底物反應(yīng)的Km值下降。在pH 5時(shí)，Asp206的羧基發(fā)生解離，使得活性位點(diǎn)帶上負(fù)電荷，從而有利于帶羥基或氨基的底物的結(jié)合[12]。

Piontek等認(rèn)為Cu1與配位基團(tuán)之間的距離與其氧化還原電勢密切相關(guān)：較長的距離會產(chǎn)生較高的氧化還原電勢[11]。在結(jié)構(gòu)TvL1GYC中，由于Cu-N鍵的延長使得自由電子對銅的貢獻(xiàn)降低，造成銅表現(xiàn)出更多的“缺電子”特性，引起這種較高氧化態(tài)的不穩(wěn)定，因而提高了氧化還原電勢。而Cu-N鍵的增加可能是由于 Ser113和 Glu460形成了氫鍵，導(dǎo)致His458遠(yuǎn)離了Cu1 (圖3)。R1G1V10的結(jié)構(gòu)也驗(yàn)證了上述猜想[7]，該酶也同樣屬于高 E0的漆酶，其Glu459與 Ser113形成了一個很強(qiáng)的氫鍵，使得Cu1-His配位鍵的距離達(dá)到了 2.2?。序列數(shù)據(jù)顯示Glu460和Ser113在所有高電勢漆酶中高度保守。根據(jù)TtL2HRG結(jié)構(gòu)，Matera等[14]提出，在Cu1附近的2個疏水性氨基酸殘基Phe460和Ile452導(dǎo)致了高氧化還原電勢的產(chǎn)生，此外，Phe460周邊大量的疏水性殘基也可能對Cu1的高電勢作出了貢獻(xiàn)。

綜上所述，漆酶Cu1的氧化還原電勢不能歸結(jié)于某單一結(jié)構(gòu)，而是多種因素共同作用的結(jié)果，如Cu1的配位體結(jié)構(gòu)和周邊殘基的特性。此外，底物的位阻效應(yīng)也是影響漆酶反應(yīng)偏好性的重要因素[24]，來自T. villosa和M. thermophila的2個漆酶具有顯著不同的氧化還原電勢 (分別為0.79V和0.46V)，2個苯丙氨酸 (Phe332和Phe265) 形成了進(jìn)入活性位點(diǎn)的入口，因?yàn)樗鼈冎g距離的不同從而決定了進(jìn)入活性位點(diǎn)的底物具有不同的氧化還原電勢(圖 2B)。

圖3 TvL1GYC結(jié)構(gòu)中由于Ser113和Glu460形成了氫鍵，導(dǎo)致His458遠(yuǎn)離了Cu1Fig. 3 The His458 moved a way from Cu1 as a result of the H bond between Ser113 and Glu460 in TvL1GYC structure.

1.3 TNC及其與分子氧的反應(yīng)

另外3個銅離子分別屬于Cu2和Cu3，以三角形式形成三核中心 (TNC)，與 4個非常保守的His-X-His序列配位，其中6個組氨酸與2個Cu3形成配位鍵，另2個組氨酸與Cu2配位。Cu2離子呈順磁性，而2個Cu3離子為耦合的離子對，為抗磁性。Cu3在330nm處有寬的吸收峰，Cu2則沒有特征的吸收峰[25]。TNC的作用是結(jié)合分子氧，利用從單核中心Cu1傳遞過來的4個電子將分子氧還原成水[10]。對具體催化細(xì)節(jié)目前還比較有爭議。Lee等認(rèn)為[19]：從全還原狀態(tài)的酶到氧分子的2個連續(xù)的雙電子轉(zhuǎn)移過程中產(chǎn)生 2個中間體形式，即過氧中間體 (PI：peroxy intermediate) 和天然中間體 (NI：native intermediate) (圖4)。第一步雙電子轉(zhuǎn)移是限速步驟，而包括2個電子還原性的切割O-O鍵的第二步反應(yīng)則快得多。處于完全還原狀態(tài)時(shí)，TNC具有配體不飽和性[26]，附近殘基的陰離子電荷則穩(wěn)定了帶有高正電荷的TNC，特別是在Cu2附近高度保守的陰離子殘基 (如在TvL1KYA的D77) 在這個反應(yīng)過程中起著非常關(guān)鍵的作用[20,26]。NI時(shí)氧分子被完全還原成水但還保持在三核中心，其所有連接鍵的結(jié)構(gòu)更有利于電子在三核中心重排[20]。相反，當(dāng)酶處于靜止態(tài)形式 (Resting form) 時(shí)，Cu2就會從這些連接鍵中脫離出來。在沒有還原性底物存在時(shí)，NI衰減成靜止態(tài)會非常緩慢，因此 NI應(yīng)該是酶完全氧化時(shí)的形式[19]。事實(shí)上NI衰減成靜止態(tài)過程涉及到氧原子從三核中心由內(nèi)而外的結(jié)構(gòu)重組，1個剩余的氧原子以O(shè)H?的形式與 Cu2結(jié)合，2個 Cu3核心也與 1個 OH?配位成鍵[27]。大致上，4個銅原子在還原底物的作用下，首先Cu1被還原，然后通過Cu-S(Cys)-N(His) 途徑，將TNC的3個銅逐個還原。對于還原順序，Yoon等提出了一個比較合理的機(jī)制[27]，因?yàn)樵贑u2和Cu3b附近存在有帶負(fù)電荷的殘基，因此Cu3a第一個被還原，之后，Cu2會被還原，剩下的Cu3b通過位于Cu1和Cu3核心之間的 Cys-His途徑得以快速還原并伴隨著 2個水分子的釋放。如果Cu3b的還原早于Cu2就會導(dǎo)致OH?配位鍵的質(zhì)子化，造成Cu2-Cu3b間電子耦合力的下降，最終無法將電子傳遞給Cu2。

圖4 MCO還原分子氧成水分子的機(jī)理Fig. 4 Mechanism of O2reduction to water by the MCOs.

在蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)部有2個通向TNC的溶劑通道，第1個指向2個Cu3離子，使得氧分子可以進(jìn)入并結(jié)合TNC，第2個通道位于TNC另一邊通向Cu2，當(dāng)氧分子還原成水分子后從該通道釋放[11,13]。

2 漆酶的反應(yīng)及其應(yīng)用前景

酚類化合物是典型的漆酶底物，它們的氧化還原電勢較低，可以允許電子傳遞給 Cu1。丁香醛連氮 (Syringaldazine)、DMP和鄰甲氧基苯酚是最常見的酚類底物，但漆酶也能氧化其他的一些電子供體底物如ABTS或氰亞鐵酸鹽[28]。反應(yīng)過程中，酚被氧化成苯氧自由基，根據(jù)反應(yīng)條件的不同，可以進(jìn)一步通過自由基耦合反應(yīng)產(chǎn)生聚合、或重排產(chǎn)生苯醌、或?qū)е峦榛?芳香基斷裂、Cα的氧化以及Cα?Cβ和芳香環(huán)的斷裂[29]。Xu比較了若干漆酶對一系列苯酚類、苯胺類和苯硫酚類底物的催化反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)催化效率與底物結(jié)構(gòu)以及Cu1和底物間單電子氧化還原電勢差密切相關(guān)[30]，而當(dāng)?shù)孜镌趏-和p-位置同時(shí)存在基團(tuán)時(shí)，T. trogii漆酶催化底物反應(yīng)效率會明顯增加。因此，底物的原子空間排布和氧化還原電勢與漆酶催化反應(yīng)效率密切相關(guān)[24]。

漆酶不能直接氧化具有高氧化還原電勢的底物，但一些白腐真菌漆酶在木質(zhì)素降解中發(fā)揮著重要作用。一些相應(yīng)的化合物 (稱為介體mediator) 作為漆酶的中介底物，使漆酶可以間接催化大分子底物和非芳香族化合物的氧化反應(yīng)[31]。針對紙漿去木質(zhì)素的漆酶/介體系統(tǒng) (LMS) 使用的第一個介體是ABTS，之后大約有100多個化合物用作介體來測試氧化木質(zhì)素的能力。一個有效的介體應(yīng)該是一個合適的漆酶底物，它氧化后的自由基具有較長的半衰期，并帶有較高的氧化電位。N-O·自由基在活性和穩(wěn)定性方面比苯氧自由基顯得更加平衡[32]，因此木質(zhì)素降解中最有效的介體都含有N?OH基團(tuán)的氮雜環(huán)化合物，特別是1-羥基苯并三唑 (HBT)。

Jeon等比較了在含有不同介體組成的“雞尾酒”配方下 G. lucidum漆酶氧化五氯苯酚 (PCP) 的能力，發(fā)現(xiàn)“雞尾酒”混合物比單個介體更能提高漆酶氧化PCP的能力。相比較香草醛和乙酰香蘭酮，G. lucidum漆酶更傾向于利用 ABTS作為介體，但ABTS自由基和香草醛 (或乙酰香蘭酮) 的同時(shí)存在可以顯著地加快PCP的氧化并伴隨著電子從香草醛 (或乙酰香蘭酮) 到 ABTS自由基的轉(zhuǎn)移[33]。這些結(jié)果顯示香草醛和乙酰香蘭酮介導(dǎo)ABTS和PCP之間的反應(yīng)是通過漆酶和這些介體之間連續(xù)的電子傳遞而實(shí)現(xiàn)的。

漆酶具有寬泛的底物氧化能力，并能夠利用氧分子作為電子受體，因此作為生物催化劑被廣泛地應(yīng)用于多個領(lǐng)域。在紙漿去木質(zhì)素、生物漂白、工業(yè)廢水凈化、紡織染色工業(yè)、飲料果汁加工以及生物傳感器和生物電池的加工等領(lǐng)域都具有很大的潛在應(yīng)用價(jià)值[34]。近年來的若干研究集中在如何利用漆酶對工業(yè)染料進(jìn)行降解，大部分工作都利用了可用的商業(yè)化染料作為模型污染物[35]，并取得了很好的效果，甚至對皮革工業(yè)中使用的偶氮染料，漆酶亦具有較好的脫色效果[36]。從P. ostreatus中制備的漆酶混合物甚至可以對RBBR蒽醌染料進(jìn)行脫色反應(yīng)并達(dá)到70%的效果，當(dāng)該制備物被固定化后還可以重復(fù)使用[37]。然而，真正的工業(yè)廢水常常包括多種染料，對于混合的染料降解取得的數(shù)據(jù)還比較有限。這也是今后漆酶在應(yīng)用領(lǐng)域的一個研究熱點(diǎn)。目前，利用漆酶對模擬的紡織工業(yè)廢水染料混合物的降解作用已經(jīng)在 SOPHIED EU計(jì)劃 (NMP2-CT-2004-505899，6FP) 框架下進(jìn)行了成功的測試，標(biāo)志著這項(xiàng)技術(shù)在紡織染料廢水處理中實(shí)際應(yīng)用的可能性。

漆酶亦可應(yīng)用于化學(xué)合成。例如漆酶催化反應(yīng)可用來將兒茶酚單體聚合成聚鄰苯二酚或產(chǎn)生惰性苯酚類聚合物 (如多聚萘酚)[38]。這些聚合物可以用于復(fù)合木材、纖維焊接、薄片材料、涂料和粘合劑的制備。而利用漆酶催化的交聯(lián)反應(yīng)原理設(shè)計(jì)的一個酶促聚合反應(yīng)系統(tǒng)可以用來生產(chǎn)人造漆聚合膜(日本傳統(tǒng)涂料)。漆酶也被用于染料合成和制藥業(yè)，如制備抗癌劑actinocin或植物抗毒素resveratrol[39]。

此外，合適的LMS系統(tǒng)能夠很有效地降解芳香族化合污染物、漂白紙漿、控制樹脂障礙以及進(jìn)行染料脫色[40]。但利用工業(yè)合成這些介體并不可取，因?yàn)槌杀据^高并且可能會產(chǎn)生有毒物質(zhì)。天然介體的使用更有利于LMS系統(tǒng)的應(yīng)用。事實(shí)上，一些木質(zhì)素衍生的苯酚類化合物已經(jīng)被證實(shí)可以介導(dǎo)漆酶的染料脫色、紙漿木質(zhì)素去除和PAH的氧化作用，比如天然對香豆酸 (對羥基苯基丙烯酸) 作為漆酶介體在降解 3,4-苯并芘時(shí)比合成的介體具有更高的效率[41]。

3 展望

對于漆酶的研究與應(yīng)用已有一百多年的歷史，特別是現(xiàn)代光譜學(xué)、晶體學(xué)和結(jié)構(gòu)量子化學(xué)等方法的應(yīng)用極大地推動了我們對漆酶的結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理的了解，進(jìn)而對漆酶在各個領(lǐng)域的應(yīng)用具有建設(shè)性的指導(dǎo)意義。然而，對漆酶的研究和了解遠(yuǎn)沒有達(dá)到預(yù)期的程度，還存在著諸如糖基如何發(fā)揮作用、電子如何在殘基之間傳遞等難題有待解決，同時(shí)如何通過蛋白質(zhì)工程來改造漆酶，進(jìn)一步提高其實(shí)際應(yīng)用范圍也是漆酶研究中的一個焦點(diǎn)。這些也為我們今后研究漆酶提供了豐富的素材，而未來更多更高分辨率漆酶結(jié)構(gòu)的解析以及各種新技術(shù)新方法的引入則是解答這些難題的關(guān)鍵。

總之，漆酶是一個古老的酶蛋白，具有很廣闊的應(yīng)用前景。無論是作為一個結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究模型，還是在不久的將來作為綠色環(huán)保工具(Green tool) 應(yīng)用于生物技術(shù)工業(yè)，都具有非常巨大的實(shí)用性價(jià)值。

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Structure, catalytic mechanism and applications of laccases: a review

Honghua Ge, Yun Wu, and Yazhong Xiao
Modern Experiment Technology Center & School of Life Sciences, Anhui University, Hefei 230039, China