白亞磊，徐慶陽，謝希賢，陳 寧

(工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

溶氧控制對黃色短桿菌YILW合成L-異亮氨酸的影響

白亞磊，徐慶陽，謝希賢，陳 寧

(工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

對黃色短桿菌YILW合成L–異亮氨酸的發(fā)酵溶氧條件進(jìn)行了探索，構(gòu)建了該菌合成L–異亮氨酸的代謝網(wǎng)絡(luò)和代謝流平衡模型．在 30 L發(fā)酵罐中考察了不同溶氧濃度下 L–異亮氨酸發(fā)酵過程．研究結(jié)果表明：高溶氧濃度有利于菌體生長，15%溶氧濃度下產(chǎn)酸速率高且維持的時間長，有利于 L–異亮氨酸的積累．為此提出了分段控氧模式：在菌體生長期，溶氧濃度控制為 25%；在產(chǎn)酸穩(wěn)定期，溶氧濃度控制為15%．在此溶氧控制模式下，在30 L發(fā)酵罐上補(bǔ)料分批發(fā)酵60 h，L–異亮氨酸產(chǎn)量可達(dá)31.8 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率可達(dá)18.3%，且乳酸、丙氨酸等副酸明顯減少．對此結(jié)果運(yùn)用代謝流分析的方法進(jìn)行論證，旨在從量的角度理解溶氧對 L–異亮氨酸合成的影響提供理論基礎(chǔ)，對進(jìn)一步優(yōu)化 L–異亮氨酸發(fā)酵溶氧條件提供理論指導(dǎo)．

L–異亮氨酸；溶氧；分段控氧模式；代謝流分析

Abstract：The condition of dissolved oxygen of L-isoleucine synthesis in Brevibacterium flavum YILW was explored，and the metabolic networks and metabolic flux balance model were constructed. The fermentation processes were studied on the condition of different dissolved oxygen in 30 L fermenter. The results show that high dissolved oxygen leads to bacterium growth. Higher production ratio of L-isoleucine maintains a long time under the condition of 15% dissolved oxygen. Thus the grading-controlling mode of dissolved oxygen was proposed： 25%dissolved oxygen concentration in the cell growth phase and 15% dissolved oxygen concentration in the phase of acid stable. Under this strategy，the yield of L-isoleucine is 31.8 g/L in 30 L fermenter in 60 h，and the conversion of sugar to acid is up to 18.3%. The vice acid is reduced significantly such as lactic，alanine. The results was demonstrated by using the method of metabolic flux analysis，providing a theoretical basis for the in-depth understanding from the perspective of the amount of dissolved oxygen on L-isoleucine fermentation，and providing a theoretical guidance for further optimization of L-isoleucine fermentation condition of dissolved oxygen.

Keywords：L-isoleucine；dissolved oxygen；phase oxygen control model；metabolic flux analysis

L–異亮氨酸(Ile)是人體8種必需氨基酸之一，除用于一般營養(yǎng)型復(fù)合氨基酸輸液、要素膳外，還大量用于配制治療型特種氨基酸輸液，如肝安、腎安氨基酸輸液，對治療各種肝臟疾病具有顯著療效[1]．

由葡萄糖直接合成 L–異亮氨酸的途徑較長且復(fù)雜．常高峰等[2]通過對黃色短桿菌生產(chǎn) L–異亮氨酸的發(fā)酵代謝分析得出，在 L–異亮氨酸的發(fā)酵過程中有纈氨酸、丙氨酸及乳酸等雜酸積累，副產(chǎn)物的生成造成了碳源的浪費(fèi)．王健等[3]通過對 L–異亮氨酸的代謝途徑分析得出，減弱TCA循環(huán)和乙醛酸支路，可以使更多的碳架流轉(zhuǎn)向異亮氨酸的合成．宋文軍等[4]研究表明，在 L–異亮氨酸生物合成中，若 TCA 途徑流量過大，會導(dǎo)致 L–異亮氨酸的代謝流減少．故減弱TCA途徑可以提高發(fā)酵過程中 L–異亮氨酸產(chǎn)酸水平．但是采取不同的措施，究竟對L–異亮氨酸的代謝流分布的影響有多大，尚未從量的角度給以闡釋．

本文考察了不同階段的溶氧供應(yīng)量，確定了不同階段最佳溶氧供應(yīng)量；采用代謝流分析方法，定量地描述了溶氧條件優(yōu)化前后黃色短桿菌YILW合成L–異亮氨酸代謝流的分布．為進(jìn)一步改造菌種及優(yōu)化發(fā)酵過程控制，從而提高 L–異亮氨酸的發(fā)酵得率提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 菌株

黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)YILW(LeuL＋AHVr＋SGr＋Leu-MEr)為天津科技大學(xué)代謝工程研究室保藏菌種．

1.2 培養(yǎng)基(g/L)

活化培養(yǎng)基：葡萄糖 1，酵母粉 5，蛋白胨 10，氯化鈉 2.5，瓊脂 25，pH,7.0～7.2，0.1,MPa滅菌 20,min．

種子培養(yǎng)基：葡萄糖30，酵母粉5，(NH4)2SO4,3，KH2PO4·3H2O,1.5 ，MgSO4·7H2O,0.6 ，F(xiàn)eSO4·7H2O,0.01，MnSO4·H2O,0.01，玉米漿 30,mL，豆餅水解液30,mL，pH,7.0～7.2，0.1,MPa,滅菌 15,min．

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 80，(NH4)2SO4,4，F(xiàn)eSO4·7H2O,0.015 ，MgSO4·7H2O,0.5 ，MnSO4·H2O,0.015 ，KH2PO4·3H2O,1.5 ，K2HPO4·3H2O,3 ，VH,100,μg ，VB15,mg，豆餅水解液 20,mL，玉米漿 15,mL，pH,7.0～7.2，0.075,,MPa,滅菌 15,min．

1.3 培養(yǎng)方法

活化斜面培養(yǎng)：31,℃恒溫培養(yǎng)36,h．

5,L種子罐(上海保興生物設(shè)備工程有限公司)培養(yǎng)：吸取適量無菌生理鹽水于5支活化斜面中，將所有菌懸液接入裝5,L種子罐中，初始裝液量為3,L，初始通氣量 2,L/min，攪拌轉(zhuǎn)速 300～600,r/min，通過自動流加氨水控制 pH(7.0±0.2)，培養(yǎng)溫度 31,℃，以泡敵消泡．培養(yǎng)12,h后，按10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中．

30,L發(fā)酵罐(上海保興生物設(shè)備工程有限公司)培養(yǎng)：按10%接種量將種子液接入30,L發(fā)酵罐中，初始裝液量為 16,L，發(fā)酵中后期流加 80%液體葡萄糖，初始通氣量1,m3/h；攪拌轉(zhuǎn)速300～800,r/min；通過自動流加氨水控制pH(7.0±0.2)，培養(yǎng)溫度 31,℃，以泡敵消泡，發(fā)酵60,h．

1.4 測定方法

菌體濃度測定：發(fā)酵液經(jīng)蒸餾水稀釋20倍后，在波長 560,nm 下用 V–1200型分光光度計(上海美譜達(dá)儀器有限公司)測定吸光度．

菌體生物量測定：菌體生物量以菌體干質(zhì)量表示，取10 mL發(fā)酵液，8 000 r/min離心10 min，將菌體用蒸餾水洗滌 2次后置于 DZF–6020型真空干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司)中，80,℃干燥至恒質(zhì)量，用 FA2204B型分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)稱質(zhì)量．

溶氧及 pH測定(Oxyferm 225型溶氧電極、Easyferm Plus,225型pH電極，Hamilton公司)：在線測定．溶氧標(biāo)定以飽和亞硫酸鈉溶液中的氧氣濃度為0，以空氣中的氧氣濃度為100%．

葡萄糖及乳酸濃度：采用 SBA–40C型生物傳感儀(山東省科學(xué)院生物研究所)進(jìn)行測定．

L–異亮氨酸、其他氨基酸濃度的測定：L–異亮氨酸及其他氨基酸含量采用 Agilent,1200型高效液相分析系統(tǒng)(Agilent Technologies公司)測定，色譜分離條件：Agilent C18(150,mm×4.6 mm，3.5,μm)為色譜分離柱，2，4–二硝基氟苯柱前衍生測定，乙腈與 NaAc溶液進(jìn)行梯度洗脫，柱溫 33,℃，流動相流量1,mL/min，檢測波長360,nm．

1.5 數(shù)據(jù)處理

發(fā)酵過程中菌體比生長速率μ根據(jù)式(1)計算[5]

式中：X、x均為菌體量；t為時間．用 Origin繪圖軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行微分計算，再用 Excel軟件求解不同時刻的μ．

1.6 代謝流計算

MFA以擬穩(wěn)態(tài)假設(shè)為基礎(chǔ)，假設(shè)細(xì)胞內(nèi)的中間代謝物均處于擬穩(wěn)態(tài)，即其濃度變化速率為 0．本文采用 Vallino等[6]的方法，根據(jù)物料平衡按照式(2)計算代謝物的積累速率

式中：xj(t)為第 j步反應(yīng)的反應(yīng)速率，mmol/(L·h)；xk(t)為第 k 步反應(yīng)的反應(yīng)速率，mmol/(L·h)；αj為第 j步反應(yīng)的反應(yīng)計量系數(shù)；αk為第k步反應(yīng)的反應(yīng)計量系數(shù)；ri(t)為中間代謝物i的積累速率，mmol/(L·h)．

由擬穩(wěn)態(tài)假定可得ri(t)＝0．代謝網(wǎng)絡(luò)中的m個中間代謝物構(gòu)成 m個代謝流平衡方程式，可寫成式(3)矩陣形式

式中：A，m×n維矩陣；X，n×1維矩陣，n為選定的速率總數(shù)目．

這樣由m個中間代謝物即可得到m個關(guān)于速率的約束條件，待解問題的自由度為 F＝n－m，通過實驗測出F個不相關(guān)速率即可確定胞內(nèi)整體流量分布，從而對其生理行為進(jìn)行定量的描述．

2 結(jié)果與討論

2.1 不同溶氧濃度條件對菌體生長的影響

由于菌體在不同生理階段對氧的需求不同，溶氧過高或過低都對正常發(fā)酵過程不利．溶氧過高會導(dǎo)致后期菌的活力降低，溶氧過低會影響前期菌體的生長[7–8]．因此考察 5%、15%、25%、35%和 45%溶氧條件下對 L–異亮氨酸發(fā)酵過程中菌體量的影響，結(jié)果如圖1所示．

圖1 不同溶氧濃度條件對菌體生長的影響Fig.1 Different dissolved oxygen conditions on cell growth

由圖 1可知：隨著溶氧濃度的增大，比生長速率和生物量都在逐漸增大；當(dāng)溶氧濃度達(dá)到 25%后，溶氧濃度再增加，比生長速率和生物量增加的幅度都很?。@表明當(dāng)溶氧濃度控制在 25%、35%和 45%時，比較有利于細(xì)胞生長，可保持較快的生長速率，且在20,h后 3種情況下的菌體量基本達(dá)到穩(wěn)定，高達(dá)21,g/L．當(dāng)溶氧較低時，菌體的生長呼吸得不到滿足，生長受限，致使菌體濃度過低，影響發(fā)酵中后期 L–異亮氨酸的產(chǎn)酸速率．綜合考慮確定 25%溶氧作為菌體生長的最適溶氧濃度．

2.2 不同溶氧條件對產(chǎn)酸穩(wěn)定期產(chǎn)酸速率的影響

根據(jù)上述菌體生長曲線可知，在發(fā)酵前 20,h基本上完成了菌體量的積累，20,h后進(jìn)入產(chǎn)酸穩(wěn)定期．以下考察了產(chǎn)酸穩(wěn)定期，即發(fā)酵 20,h后，分別以5%、15%、25%、35%、45%的溶氧濃度控制時的產(chǎn)酸速率，結(jié)果如圖2所示．

圖2 不同溶氧濃度下的產(chǎn)酸速率Fig.2 Acid production rate under different dissolved oxygen

由圖2可知：在5%溶氧條件下，雖然產(chǎn)酸速率比較穩(wěn)定，但是產(chǎn)酸速率比較小，對 L–異亮氨酸的積累不利；在 35%和 45%溶氧條件下，雖然在產(chǎn)酸穩(wěn)定期開始時有較高的產(chǎn)酸速率，但是隨著發(fā)酵時間的延長，產(chǎn)酸速率呈下降趨勢，對酸的積累也有影響；而在15%和 25%溶氧條件下，產(chǎn)酸穩(wěn)定期開始時不但有較高的產(chǎn)酸速率，高達(dá) 0.6,g/(L·h)，而且較高的產(chǎn)酸速率維持的時間也較長，有利于L–異亮氨酸的積累．

2.3 L–異亮氨酸生物合成代謝流平衡模型的建立

2.3.1 代謝網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在黃色短桿菌中，存在 EMP、TCA 和 HMP途徑，HMP途徑能為氨基酸合成提供大量的還原力NADPH，在L–異亮氨酸合成中意義重大．

基于以下原則建立代謝網(wǎng)絡(luò)：(1)細(xì)胞處于非生長時期或細(xì)胞濃度變化不大可以忽略；(2)細(xì)胞代謝過程中乙醛酸途徑微弱，所以不考慮乙醛酸循環(huán)；(3)反應(yīng)途徑產(chǎn)生的NADPH與TCA循環(huán)、HMP途徑產(chǎn)生的NADPH總數(shù)相等；(4)在細(xì)胞生長不旺盛階段，由于大量無效循環(huán)的存在，ATP 的消耗量和細(xì)胞維持能總量并不相等，因此本文不考慮 ATP總量的平衡；(5)按固定比例進(jìn)行的反應(yīng)以及無分支的中間反應(yīng)，盡量簡化為一個反應(yīng)方程；(6)本文所用菌株為亮氨酸滲漏型，所以不考慮亮氨酸支路．L–異亮氨酸合成代謝網(wǎng)絡(luò)圖如圖3所示．

圖3 L–異亮氨酸生物合成代謝網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Biosynthesis metabolic network of L-isoleucine

2.3.2 代謝流平衡模型方程組的建立

根據(jù)以上分析及有關(guān)的文獻(xiàn)[9]報道，代謝節(jié)點(diǎn)處的方程如下：

方程組由 19個方程組成，27個未知數(shù)，自由度為 8，只需要測定發(fā)酵液中 8種物質(zhì)的反應(yīng)速率就可確定代謝流的分配情況，在本實驗所用的發(fā)酵液中檢出葡萄糖、異亮氨酸、丙氨酸、賴氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、谷氨酸及乳酸的濃度，計算各自的消耗或積累速率，結(jié)果見表1．

表1 產(chǎn)酸穩(wěn)定期主要代謝產(chǎn)物變化速率Tab.1 Variation rate of major metabolite in the phase of acid stable

利用 Matlab軟件linprog函數(shù)，結(jié)合表1中測得的代謝物的消耗或累計速率，為了便于計算，葡萄糖摩爾消耗速率假定為 100,mmol/(L·h)，求得兩種溶氧條件下的代謝流分布如圖4所示．

進(jìn)入產(chǎn)酸穩(wěn)定期，菌體基本不再增長，碳架導(dǎo)向L–異亮氨酸的合成．天冬氨酸為 L–異亮氨酸生物合成的前體，增大天冬氨酸的代謝流可以提高 L–異亮氨酸產(chǎn)量，而天冬氨酸又由草酰乙酸合成，因此，增大磷酸烯醇式丙酮酸到草酰乙酸的流量有利于更多的碳架流向目的產(chǎn)物．HMP途徑作為提供 NADPH的主要途徑，增大HMP途徑的代謝流是提高L–異亮氨酸生物合成所必需的[10]．由圖 4可以看出：產(chǎn)酸穩(wěn)定期內(nèi)，在 15%和 25%溶氧條件下，由磷酸烯醇式丙酮酸通往草酰乙酸的r17流量分別為31.78,mmol/(L·h)和 30.11,mmol/(L·h)，其中流向 L–異亮氨酸分別為25.38,mmol/(L·h)和 24.30,mmol/(L·h)；通往 HMP 途徑的 r,6流量分別為 20.51,mmol/(L·h)和 11.06,mmol/(L·h)；同時在 15%溶氧條件下，乳酸、丙氨酸等副酸比在 25%條件下的流量要小．比較兩種情況下的代謝流分布，在15%溶氧下的代謝流分布比在25%溶氧下的更有利于 L–異亮氨酸的積累．故在產(chǎn)酸穩(wěn)定期，在 15%溶氧控制條件下，更多的碳架導(dǎo)向了 L–異亮氨酸的合成．這也說明了圖 2中 15%溶氧條件下比在25%溶氧下產(chǎn)酸速率高的原因．

綜上所述，發(fā)酵前期是菌體生長旺盛的時期，L–異亮氨酸合成量較少，提高溶氧濃度有利于菌體生長，25%溶氧較為適合生長期菌體生長需要．在產(chǎn)酸穩(wěn)定期，菌體濃度基本不變，L–異亮氨酸大量合成，降低溶氧濃度，可增加前體物質(zhì)天冬氨酸和NADPH的量，使得通往 L–異亮氨酸的代謝流增加．運(yùn)用代謝流分析可知：15%溶氧下更有利于產(chǎn)酸穩(wěn)定期 L–異亮氨酸的積累．

圖4 產(chǎn)酸穩(wěn)定期的代謝流分布圖Fig.4 Metabolic flux distribution in the phase of acid stable

2.4 產(chǎn)酸穩(wěn)定期兩種控氧模式下 L–異亮氨酸及主要副酸的變化情況

在產(chǎn)酸穩(wěn)定期控制不同溶氧，由圖5兩種溶氧控制策略下的目的產(chǎn)物與副酸的累積量可知：在 15%溶氧條件下，目的產(chǎn)物 L–異亮氨酸的累積量比在 25%溶氧條件下的大；而乳酸、丙氨酸等副酸的累積量相對 25%溶氧下有所減少，這與上述代謝流分析結(jié)果是一致的．

圖5 產(chǎn)酸穩(wěn)定期的主產(chǎn)物與副酸累積量Fig.5 Accumulation of the main product and vice acid in Fig.5 the phase of acid stable

3 結(jié) 論

在 L–異亮氨酸發(fā)酵過程中，在不同溶氧條件下，L–異亮氨酸的累積量有很大的不同，15%溶氧時為31.8,g/L，25%時為 27.3,g/L．因此根據(jù)代謝流分析結(jié)果確立了溶氧分段控制模式：菌體生長期，維持溶氧25%；產(chǎn)酸穩(wěn)定期，維持溶氧 15%．在該溶氧控制模式下，通過 30,L罐補(bǔ)料分批發(fā)酵 60,h，產(chǎn)酸可達(dá)31.8,g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率可達(dá) 18.3%，同時副酸的積累也大大下降．由此說明，在 L–異亮氨酸發(fā)酵過程中，溶氧的控制對發(fā)酵過程有很大的影響，在不同的階段控制不同的溶氧水平，不但對目的產(chǎn)物的累積量有很大影響，同時對副產(chǎn)物的積累也有很大的影響，副酸的減少不但可以減少發(fā)酵過程中的原料浪費(fèi)，而且還對下游提取工作有利，可以降低提取難度和減少提取過程中的能耗．

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Effect of Dissolved Oxygen Control on L-isoleucine Synthesis by Brevibacterium flavum YILW

BAI Ya-lei，XU Qing-yang，XIE Xi-xian，CHEN Ning
(Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

Q815

A

1672-6510(2011)01-0005-05

2010-09-10；

2010-11-16

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計劃項目(08JCZDJC15400)

白亞磊（1985—），男，河南平頂山人，碩士研究生；通信作者：陳 寧，教授，ningch@tust.edu.cn.