吳國清，伍旭明，趙光樹，馬成堅

(1.浙江省立同德醫(yī)院，浙江 杭州 310012; 2.浙江省中醫(yī)院，浙江 杭州 310006;3.浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310009)

仙茅是石蒜科多年生草本植物仙茅 Curculigo orchioides的根莖，是補腎助陽的傳統(tǒng)中藥，能補腎陽、強筋骨、祛寒濕，在治療“骨瘺”“骨痹”“腰背痛”“虛損”等中醫(yī)證候時常用其加減配伍，但其確切藥理機制還不明晰。筆者以小鼠成骨細胞MC3T3－E1為細胞模型進行體外試驗，觀察仙茅醇提液對成骨細胞增殖的影響。

1 儀器與試藥

CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Forma Scientific);倒置相差顯微鏡(日本Olympus，);全自動酶標讀數儀(日本DYNEX公司)。仙茅藥材購自浙江省杭州市華東醫(yī)藥有限公司藥材參茸分公司。MC3T3－E1細胞由浙江大學傳染病研究所保存。3－(4，5－二甲基－2－噻唑)－2，5－二苯基溴化四氮唑鹽(MTT，粉劑，美國Sigma公司)用磷酸鹽緩沖液配成質量濃度為5 g/L的溶液，過濾除菌，4℃避光保存，2周內有效。細胞培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基(美國GIBCO公司);0.25%胰酶消化液(美國GIBCO公司)，－20℃保存?zhèn)溆?PAA胎牛血清(上海微科生物有限公司)，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法與結果

2.1 藥物制備

將仙茅粉碎過20目篩，稱取100 g，以75%乙醇水浴回流提取3次(1 h/次)，回收乙醇，配成大約相當于生藥材1 g/mL的儲備液，0.45 μm微膜過濾、除菌，4℃保存?zhèn)溆谩Ｔ囼灂r用無血清DMEM培養(yǎng)基依次稀釋成終濃度為 1 ∶250，1 ∶500，1 ∶1 000，1∶1 500的溶液。

2.2 MC3T3－E1細胞的培養(yǎng)和增殖檢測

將成骨樣細胞MC3T3－E1接種于培養(yǎng)瓶中，置37℃、飽和濕度、CO2分壓為5%的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)傳代。選取傳至第3代、生長旺盛的MC3T3－E1成骨樣細胞，用4%胎牛血清成骨樣細胞培養(yǎng)基配制成5×104個/mL成骨樣細胞懸液，接種于96孔成骨樣細胞培養(yǎng)板，貼壁生長24 h后，移除血清，加入不同梯度濃度的仙茅提取物，每個濃度4個復孔。于37℃和5%CO2培養(yǎng)箱48 h后，每孔加入30 μL MTT溶液(2 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸凈上清液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，振蕩5～15 min，使MTT還原產物結晶完全溶解，用酶聯免疫檢測儀測定每孔光密度值(OD值)，波長為570 nm。以含有等體積的未加仙茅提取物的細胞孔測得的吸光度值為對照，將不同濃度的加藥組與對照組之間進行均值比較，所得數據均經ANOVA檢驗。細胞增殖率=(實驗組－對照組)/對照組×100%。

2.3 結果

仙茅提取物和MC3T3－E1細胞共孵育48 h后，低濃度(1∶1 500)對細胞增殖沒有影響，中濃度(1∶1 000)對細胞增殖影響明顯，隨著藥物濃度的增加，對MC3T3－E1細胞增殖的影響也明顯加大。結果見表1和圖1。

表1 仙茅提取物對MC3T3－E1細胞增殖的影響(A值，±s，n=4)

表1 仙茅提取物對MC3T3－E1細胞增殖的影響(A值，±s，n=4)

注:與對照組比較，△P ＜0.05，▲P ＜0.01。

藥物濃度1∶1 500 1∶1 000 1∶500 1∶250加藥組0.83 ± 0.05 0.95 ± 0.06△1.11 ± 0.15△1.33 ± 0.05▲對照組0.73 ± 0.10增殖率(%)6.0 21.7 51.9 66.3

3 討論

圖1 與仙茅提取物共孵育后MC3T3－E1細胞生長曲線(λ=570 nm)

中醫(yī)理論認為，腎與骨的關系非常密切?！端貑栃魑鍤庹摗氛f:“五臟所主，腎主骨?！薄端貑枴蟠笳摗氛f:“腎生骨髓，腎精充足，則骨髓生化有源，骨得髓的充分滋養(yǎng)而堅固有力?！备鶕澳I主骨”理論，補腎陽、強筋骨的仙茅常配伍加減用于“骨瘺”“骨痹”“腰背痛”“虛損”等癥，且取得一定效果[1－2]。在骨折修復和骨質疏松癥的發(fā)生發(fā)展中，成骨細胞扮演著關鍵角色。MC3T3－E1細胞株是1981年Sudo H和Kodama HA等[3]從新生C57BL/6小鼠顱蓋骨中分離培養(yǎng)建株的成骨細胞株，該細胞株具有體外培養(yǎng)成骨細胞的各種生物學特性，包括堿性磷酸酶(ALP)活性、Ⅰ型膠原合成和基質鈣化等特性，常作為骨代謝研究的細胞模型。

本研究結果表明，仙茅提取物能明顯促進MC3T3－E1成骨細胞的增殖，且增殖影響大小與其濃度有密切關系。因此加速成骨細胞的增殖與分化，增強成骨細胞活性，使骨量增加，促進骨修復和骨形成，可能是仙茅能用于骨質疏松癥治療的部分機制，這也與很多抗骨質疏松的“補腎”中藥研究報道相符[4－7]。

仙茅中含有皂苷類、酚類、木脂素類、黃酮類、桉烷類、甜味蛋白和多糖類成分[8]，仙茅苷是其最主要的活性成分。本研究采用的是仙茅粗提物，具體是哪一個活性單體對MC3T3－E1細胞具有增殖活性，其是否影響成骨細胞的堿性磷酸酶、血管內皮生長因子等的表達等確切內在機制，尚需在后續(xù)實驗中進一步探討。

[1]王長海，張仲海.二仙湯治療骨質疏松癥50例[J].陜西中醫(yī)，1998，15(5):205.

[2]張貴有.二仙湯治療腰痛驗案舉隅[J].實用中醫(yī)藥雜志，2007，23(6):381.

[3]Sudo H，Kodama H A，Amagai Y，et a1.In vitro differentiation and calcification in a new clonal osteogenie cell line derived from new－born mouse calvafia[J].J Cell Biol，1983，96(1):191 － 198.

[4]唐 琪，陳莉麗，嚴 杰.骨碎補提取物促小鼠成骨細胞株MC3T3－E1細胞增殖、分化和鈣化作用的研究[J].中國中藥雜志，2004，29(6):164－167.

[5]於文博，張大方，李麗靜，等.補腎中藥防治骨質疏松癥的研究[J].長春中醫(yī)藥大學學報，2008，24(3):262－263.

[6]肖 靜，李三華，莫寧萍.杜仲總黃酮對體外培養(yǎng)大鼠成骨細胞增殖的影響[J].遵義醫(yī)學院學報，2008，31(31):238 －240.

[7]林 軍，李幼琴，李萬紅，等.杜仲葉提取物/C PC復合載體對大鼠成骨細胞作用的實驗研究[J].浙江大學學報(醫(yī)學版)，2008，37(1):78－82.

[8]曹大鵬，鄭毅男，韓 婷，等.仙茅屬植物化學成分及生物活性研究進展[J].藥學服務與研究，2008，8(1):59－62.