江 蓓， 李保應(yīng)， 甄軍暉， 李憲花， 胡 昭， 高海青△

(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院1泌尿內(nèi)科，2老年病科，3病理科，山東濟(jì)南250012)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者最主要的微血管病變，目前已經(jīng)上升為歐美國家終末期腎臟病(endstage renal disease，ESRD)的首位病因[1]，在我國的發(fā)病率也逐年增高。DN治療費用高、療效差，嚴(yán)重影響DM患者的生活質(zhì)量和生存率，故而DN的診治一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點問題。

DN發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，包括了眾多因素參與。越來越多的研究證實DM患者體內(nèi)存在明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，而目前認(rèn)為氧化應(yīng)激是DM多種慢性并發(fā)癥不同發(fā)病機(jī)制的共同通路，氧化應(yīng)激在DM腎損害的發(fā)生、發(fā)展中也起重要作用[2]，可能是DN主要的發(fā)病機(jī)制之一。由于氧化應(yīng)激在DM及其慢性并發(fā)癥發(fā)病中的作用越來越明確，有關(guān)抗氧化劑替代治療的研究也進(jìn)一步引起重視。葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidin，GSP)屬天然抗氧化劑，我們以往的研究發(fā)現(xiàn)GSP能改善DM大鼠的腎損害，而利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探討其作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了20余個差異表達(dá)蛋白可能是GSP的作用靶點[3]。我們對其中的谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶μ亞型(glutathione S－transferases mu，GSTM)的作用進(jìn)行了進(jìn)一步研究，現(xiàn)報道如下。

材料和方法

1 材料和試劑

1.1 動物 選用健康雄性Wistar大鼠，鼠齡10周，體重200－220 g，購買并飼養(yǎng)于山東大學(xué)實驗動物中心(合格證號D20021024)。

1.2 抗體和試劑 鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma)、GSTMⅠ抗、核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor－erythroid 2－related factor 2，Nrf2)Ⅰ抗(Abcam)、Ⅱ抗(博士德生物工程有限公司)、GSP(天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司生產(chǎn)，批號為G050412。高效液相法分析GSP顯示:原花青素含量96.63%)。

2 方法

2.1 糖尿病大鼠模型的建立及分組 健康雄性Wistar大鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，禁食12h開始實驗。隨機(jī)選取12只作為正常對照組(C組)，其余48只用來建立糖尿病大鼠模型，作為糖尿病組(DM組)。正常對照組一次性尾靜脈注射0.1%檸檬酸緩沖液，糖尿病組一次性尾靜脈注射0.1%STZ檸檬酸緩沖液55 mg/kg，5 d后取鼠尾血測定血糖，篩選模型成功的大鼠。以STZ注射5 d后，空腹血糖水平≥16.7 mmol/L為糖尿病模型成功的標(biāo)準(zhǔn)。成模后糖尿病大鼠40只，隨機(jī)分為糖尿病組20只，糖尿病GSP治療組20只。穩(wěn)定1周后開始實驗。正常對照組(C組)、糖尿病組(DM組)每天給予生理鹽水灌胃;GSP治療組(GSP組)每天GSP 250 mg/kg灌胃。

2.2 標(biāo)本的收集 所有大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，持續(xù)觀察24周，每周用血糖儀(強(qiáng)生公司One－Touch Ultra)鼠尾取血測空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)PG)，并測量體重(body weight，BW)，每 6 周檢測鼠尾動脈收縮壓。于第24周末處死大鼠，取血、留尿、取腎組織。

①尿標(biāo)本的留取 各組大鼠處死前24 h將其置入代謝籠中，自由進(jìn)食和飲水，收集24 h尿液，記錄尿量后取4 mL，2 000 r/min離心10 min，去除沉淀置于－20℃冰箱保存，待測尿蛋白。

②血標(biāo)本的留取 處死大鼠后立即穿刺心臟取血4 mL，靜置后4 000 r/min離心10 min，收集血清，－20℃冰箱保存待測。

③腎組織的留取 處死大鼠后迅速開腹，分離摘取腎臟，修剪掉纖維結(jié)締組織，0.9%冰生理鹽水沖洗，濾紙吸干稱重后將其切成2－3mm厚的組織片，置于10%甲醛溶液中固定，用于制作組織切片。

2.3 檢測指標(biāo)及方法

①血壓的檢測 尾動脈收縮壓采用尾套式大鼠心率血壓測定儀(中日友好醫(yī)院生產(chǎn)，RBP－1型)測量大鼠清醒狀態(tài)下尾動脈收縮壓，每6周檢測1次，每次測3次，取其平均值。

②24 h尿蛋白測定 采用磺基水楊酸法檢測。

③腎功等指標(biāo)的測定 用Modular D2400全自動生化分析儀(羅氏公司)測定FPG、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(serum creatinine，SCr)、白蛋白、尿酸、總膽固醇、甘油三酯。高壓液相法測定糖基化血紅蛋白 A1c(glycosylated hemoglobin A1c，HbA1c)。

2.4 腎組織病理學(xué)檢查 腎組織標(biāo)本在10%甲醛溶液中固定48 h后，經(jīng)常規(guī)脫水，二甲苯透明40－60 min，浸蠟4 h，包埋成石蠟塊。切片機(jī)切片，厚約2 μm，將病理切片行PAS染色，光鏡下觀察病理改變。

2.5 Western blotting檢測 稱取組織100－200 mg，在研缽中液氮下研磨，加入500－1 000 μL的蛋白提取液，吸入1.5 mL的滅菌離心管中，冰浴20 min，4℃、14 000 r/min離心20 min，吸取上清，分裝－80℃保存。BCA法測定樣品蛋白濃度。樣品加入上樣緩沖液12%SDS－PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉后，依次加入按適當(dāng)比例稀釋的Ⅰ抗(GSTM 1∶1 000，GAPDH 1∶500)，4 ℃孵育過夜，辣根過氧化酶標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶7 500)，室溫孵育2 h，DAB顯色，應(yīng)用密度測定法定量分析相應(yīng)蛋白條帶發(fā)光度(Digital Protein DNA Imageware)。

2.6 免疫組化檢測 標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，制成切片后，放于載玻片上置烤箱60℃、60 h使石蠟溶化。切片常規(guī)脫蠟至水，經(jīng)0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)進(jìn)行熱修復(fù)，滴加5%BSA封閉液，室溫孵育20 min。加適當(dāng)稀釋的Ⅰ抗4℃過夜，漂洗后滴加酶標(biāo)Ⅱ抗。滴加SABC試劑，37℃孵育20 min。漂洗后DAB顯色，蘇木素復(fù)染。DAB染色呈棕褐色為陽性，每張切片在400倍光鏡下隨機(jī)選取觀察10個腎小球不重疊視野，根據(jù)染色的范圍和強(qiáng)度進(jìn)行半定量評分。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。

結(jié) 果

1 大鼠一般情況比較

實驗結(jié)束時，C組、DM組和GSP組大鼠存活分別為10只、9只、13只。DM組大鼠出現(xiàn)多飲、多尿、多食的表現(xiàn)，與C組大鼠比較毛色暗淡無光澤，由于消瘦及多食逐漸呈現(xiàn)大腹小頭的形態(tài)變化，尾靜脈采血后傷口不易愈合。實驗開始時3組大鼠體重?zé)o顯著差異(P＞0.05)，24周時DM組大鼠體重較C組大鼠下降，兩者差異顯著(P＜0.01)，治療后GSP組大鼠體重較DM組增加，但2組無顯著差異(P＞0.05)，見表 1。

2 GSP對收縮壓、FBG和HbA1c的影響

第24周時DM組、GSP組大鼠收縮壓、FPG和HbA1c水平與C組相比較均顯著升高(P＜0.01)。而GSP組大鼠與DM組相比較FPG和HbA1c水平降低，但兩者無顯著差異(P＞0.05);收縮壓降低，兩者差異顯著(P＜0.01)，見表1。

表1 GSP對BW、收縮壓、FPG和HbA1c的影響Table 1.Effects of GSP on body weight(BW)，systolic pressure，F(xiàn)PG and HbA1c(±s)

表1 GSP對BW、收縮壓、FPG和HbA1c的影響Table 1.Effects of GSP on body weight(BW)，systolic pressure，F(xiàn)PG and HbA1c(±s)

＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs DM group.

Group n BW(g) Systolic pressure(mmHg) FPG(mmol/L) HbA1c(%)Control 10 449.10 ±29.97 100.50 ±12.35 6.66 ±0.46 5.61 ±0.73 DM 9 210.13 ±30.05＊＊ 153.50 ±6.26＊＊ 23.03 ±3.38＊＊ 12.40 ±2.35＊＊DM+GSP 13 337.13 ±119.19 130.50 ±5.99＊＊## 21.23 ±3.92＊＊ 11.41 ±2.14＊＊

3 GSP對腎重/體重、尿蛋白和腎功能的影響

第24周時DM組和GSP組大鼠腎重/體重(kidney weight/body weight，KW/BW)、24 h 尿蛋白定量、BUN和SCr水平與C組相比較均顯著升高(P＜0.01)。而GSP組大鼠與DM組相比較，24 h尿蛋白定量和腎重/體重降低，兩者差異顯著(P＜0.01)，BUN和SCr水平降低，兩者差異顯著(P＜0.05)，見表2。

表2 GSP對大鼠KW/BW、尿蛋白和腎功能的影響Table 2.Effects of GSP on KW/BW，urine protein and renal function(±s)

表2 GSP對大鼠KW/BW、尿蛋白和腎功能的影響Table 2.Effects of GSP on KW/BW，urine protein and renal function(±s)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs DM group.

Group n KW/BW(×10－3) 24 h urine protein(mg) BUN(mmol/L) SCr(μmol/L)Control 10 7.95 ±1.14 14.12 ±2.61 7.59 ±2.98 45.67 ±6.31 DM 9 11.84 ±2.01＊＊ 45.42 ±4.78＊＊ 16.89 ±5.52＊＊ 66.00 ±10.24＊＊DM+GSP 13 9.16 ±1.05*## 17.65 ±2.51*## 11.56 ±3.75*# 56.33 ±7.83＊＊#

4 GSP對腎組織形態(tài)學(xué)的影響

光鏡下PAS染色顯示，C組大鼠細(xì)胞外基質(zhì)和系膜細(xì)胞均無明顯增加，毛細(xì)血管管腔開放良好。與C組比較，DM組大鼠腎小球細(xì)胞外基質(zhì)增多，系膜細(xì)胞增生，同時毛細(xì)血管部分塌陷，腎小囊部分黏連。GSP組治療后上述改變較DM組減輕，見圖1。

5 GSP對腎組織GSTM和Nrf2表達(dá)的影響

Western blotting檢測和免疫組化結(jié)果顯示DM組大鼠腎組織GSTM表達(dá)較C組增高，兩者差異顯著(P＜0.01)，而GSP治療后GSTM表達(dá)較DM組減低，兩者差異顯著(P ＜0.05)，見圖2、3。

免疫組化結(jié)果顯示DM組大鼠腎組織Nrf2表達(dá)較C組增高，而GSP組治療后Nrf2表達(dá)較DM組減低(P ＜0.05)，見圖4。

Figure 1.The renal pathological changes in the three groups(PAS staining，×400).A:control group;B:DM group;C:GSP treatment group.圖1 各組大鼠腎組織病理改變

Figure 2.GSTM protein expression in renal tissues.±s.＊＊P＜0.01 vs control group;#P ＜0.05 vs DM group.圖2 腎組織GSTM蛋白表達(dá)

討 論

我們以往的研究發(fā)現(xiàn)GSP作為一種天然抗氧化劑，對STZ誘導(dǎo)的DM大鼠模型腎臟損害具有一定的治療作用[3，4]。本研究結(jié)果顯示，GSP 治療組FPG、HbA1c及腎功能均較DM組有改善，24 h尿蛋白較DM組減少;而腎組織病理改變也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)GSP治療后細(xì)胞外基質(zhì)增多、系膜細(xì)胞增生情況較DM組減輕。我們利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對GSP的腎保護(hù)機(jī)制進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)了20余個差異表達(dá)蛋白可能是GSP的作用靶點[3]，其中GSTM表達(dá)在DM組較C組升高，GSP治療后GSTM表達(dá)下調(diào)。在本研究中，我們利用Western blotting和免疫組化方法檢測腎組織GSTM的表達(dá)，結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果相一致:GSTM表達(dá)在DM組較C組升高，GSP治療后GSTM表達(dá)下調(diào)。我們同時測定了腎組織Nrf2的表達(dá)，結(jié)果顯示Nrf2表達(dá)在DM組較C組升高，GSP治療后Nrf2表達(dá)下調(diào)。

以往對GSTM與DM關(guān)系的研究較少，主要集中于基因多態(tài)性，結(jié)果也不完全一致[5－7]。我們研究發(fā)現(xiàn)GSTM在DM大鼠腎組織的表達(dá)較正常增高，提示這種變化可能在DM腎損害中起一定作用。Fujita等[8]對早期2型DM小鼠模型腎臟588個基因的表達(dá)進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)GSTs中的α、μ亞型mRNA水平和蛋白質(zhì)表達(dá)均升高，該研究結(jié)果與本論文結(jié)果有一致性。

DM大鼠腎組織GSTM過表達(dá)引起腎損害的機(jī)制尚不清楚，可能通過以下途徑起作用[9－12]。(1)增強(qiáng)炎癥反應(yīng):GSTM參與炎性因子白三烯、前列腺素的代謝，GSTM過表達(dá)使前列腺素合成增加，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)。(2)抑制細(xì)胞凋亡:絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase，MAPK)信號通路是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要方式之一，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。近年來發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡信號調(diào)節(jié)激酶 1(apoptosis signal－regulating kinase 1，ASK1)活化可以激活 JNK/SAPK、p38通路級聯(lián)反應(yīng)。Cho等[10]研究發(fā)現(xiàn)，GSTM在體內(nèi)外可以直接與ASK1結(jié)合并抑制其磷酸化，從而抑制ASK1介導(dǎo)的MAPK通路而影響細(xì)胞凋亡。(3)GSTM可作為內(nèi)源性凋亡影響因子，通過影響淋巴細(xì)胞的增殖導(dǎo)致免疫損傷。已經(jīng)證實，多種應(yīng)激狀態(tài)，包括氧化應(yīng)激，可以誘導(dǎo) GSTs的表達(dá)[13]。本文結(jié)果顯示，DM大鼠腎組織GSTM表達(dá)增高，而GSTM過表達(dá)能通過影響腎臟固有細(xì)胞的正常凋亡、加重炎癥反應(yīng)等途徑加重腎臟損害，從而在DN的發(fā)生、發(fā)展中起一定作用。GSP治療可以下調(diào)腎組織GSTM的表達(dá)，從而發(fā)揮其腎保護(hù)作用。

Figure 3.GSTM protein expression in renal tissues(immunohistochemical staining，× 400).A:control group;B:DM group;C:GSP treatment group.±s.#P＜0.05 vs control group;*P＜0.05 vs DM group.圖3 腎組織GSTM表達(dá)

Figure 4.Nrf2 expression in renal tissues(immunohistochemical staining，×400).A:control group;B:DM group;C:GSP treatment group.±s.#P＜0.05 vs control group;*P＜0.05 vs DM group.圖4 腎組織Nrf2表達(dá)

Nrf2/ARE是近年新發(fā)現(xiàn)的機(jī)體抗氧化、解毒功能最重要的防御性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Nrf2是細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)系統(tǒng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，對細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)非常敏感。遇自由基或化學(xué)物質(zhì)、氧化應(yīng)激等刺激時Nrf2活化，活化的Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)結(jié)合，調(diào)節(jié)ARE下游的Ⅱ相解毒酶、抗氧化蛋白等多種解毒酶的表達(dá)[8，14]。本研究結(jié)果顯示DM大鼠腎組織Nrf2表達(dá)較C組增高，GSP治療后Nrf2表達(dá)下調(diào)，提示GSP下調(diào)DM大鼠腎組織GSTM的表達(dá)可能是通過下調(diào)上游基因Nrf2的表達(dá)實現(xiàn)的。

綜上所述，GSP作為一種天然抗氧化劑，對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型腎臟損害有一定的治療作用，調(diào)節(jié)DM大鼠腎組織GSTM的表達(dá)可能是GSP發(fā)揮腎保護(hù)作用的機(jī)制之一，而下調(diào)GSTM的表達(dá)可能是通過下調(diào)上游基因Nrf2的表達(dá)實現(xiàn)的。

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