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        熱休克蛋白參與PI3K/Akt介導H2O2預處理的抗凋亡作用*

        2011-12-23 04:07:46郭瑞鮮羅健東馮鑒強
        中國病理生理雜志 2011年8期
        關(guān)鍵詞:適應性預處理通路

        張 梅, 李 衛(wèi), 郭瑞鮮, 羅健東, 馮鑒強△

        (1 廣州醫(yī)學院藥理教研室,廣東 廣州510082;2 暨南大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科,廣東 廣州510632;3中山大學中山醫(yī)學院生理教研室,廣東 廣州510080)

        適應性細胞保護是指某些“亞傷害性”應激預處理可以減輕后續(xù)更嚴重的損害。作為機體維持穩(wěn)態(tài)的天然機制,適應性細胞保護是在不改變攻擊因子性質(zhì)的情況下,通過外源性的適宜刺激(預處理)調(diào)動機體自身的防護機制,加強細胞對損傷的抵抗能力。適應性細胞保護作用的存在為主動防治某些疾病提供了可能。本課題組利用腎上腺嗜鉻細胞瘤(PC12)細胞建立了H2O2預處理誘導的適應性細胞保護模型,以期為防御氧化應激對多巴胺能神經(jīng)元的損傷提供依據(jù)。前期研究表明,H2O2預處理誘導的適應性保護反應通過多種分子機制發(fā)揮抗細胞凋亡作用,涉及到幾條信號通路的激活。其中細胞內(nèi)一氧化氮合酶和環(huán)氧合酶2,以及JAK-STAT 和NF-κB 信號通路的激活均參與了這種適應性保護反應[1-3]。雖然H2O2預處理通過激活相關(guān)的分子和信號轉(zhuǎn)導途徑發(fā)揮其細胞保護作用,但是何種效應蛋白作為這種適應性保護功能的執(zhí)行者卻尚未清楚。熱休克蛋白(heat-shock proteins,HSP)是機體面對多種應激原如熱、活性氧、DNA 損傷、缺血、缺氧、炎癥刺激時,產(chǎn)生的一組能夠結(jié)合細胞內(nèi)具有重要功能蛋白的蛋白質(zhì),它的生理功能之一是對應激狀態(tài)下的細胞提供保護[4,5]。

        磷脂酰肌醇3-激酶/Akt (phosphatidylinositol 3-kinase/Akt,PI3K/Akt)信號通路參與多種細胞功能的調(diào)節(jié),是神經(jīng)元存活的主要途徑之一。我們最近的研究顯示,在PC12 細胞,H2O2預處理可引起Akt 活化,并且PI3K/Akt 通路的激活發(fā)揮了抗細胞凋亡的作用,參與H2O2預處理誘導的適應性保護反應[6]。HSP 作為在眾多應激情況下發(fā)揮保護作用的效應蛋白,是否參與PI3K/Akt 信號通路介導的H2O2預處理誘導的抗細胞凋亡作用,本文擬對此進行探討。

        材 料 和 方 法

        1 材料

        RPMI-1640 培養(yǎng)基購自Gibco-BRL,小牛血清購自HyClone。30% H2O2為Alfa Aesar 產(chǎn)品。Hoechst33258、胰蛋白酶、BSA、HEPES、EDTA、DMSO、碘化丙啶(propidium iodide,PI)、槲皮素(quercetin)、17-烯丙氨基-17-脫甲氧基格爾德霉素(17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin,17-AAG)和LY294002 均購自Sigma。HSP70、HSP90 抗體和化學發(fā)光試劑盒(Amersham ECL Kit)購自Cell Signaling Technology (CST);β-actin 及HRP 標記的Ⅱ抗為Santa Cruz 產(chǎn)品。BCA 蛋白定量試劑盒購自Pierce。Caspase-3 活性測定試劑盒為德國默克產(chǎn)品。

        2 方法

        2.1 細胞培養(yǎng)和預處理方法 PC12 細胞由中山大學實驗動物中心提供。于37 ℃、5%CO2的條件下,用含10%馬血清和5%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基進行培養(yǎng),選取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。H2O2預處理的實施方法如下:100 μmol/L H2O2作用PC12 細胞90 min 后,撤去H2O2,繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h,再給予300 μmol/L H2O2作用12 h。PI3K 抑制劑LY294002(25 μmol/L)、HSP70 抑制劑quercetin(50μmol/L)和HSP90 抑制劑17-AAG(100 nmol/L)分別在預處理前30 min 加入培養(yǎng)液。

        2.2 細胞凋亡的檢測

        ①Hoechst33258 染色觀察細胞凋亡形態(tài)變化 細胞接種于培養(yǎng)板內(nèi),按實驗要求給以不同的處理因素,處理終止后棄去培養(yǎng)液,細胞用PBS 洗2 次,加入新鮮配制的4%多聚甲醛,4 ℃固定細胞10 min,PBS 沖洗1 次,加5 mg/L Hoechst 33258 避光染色10 min,PBS 沖洗2 次,熒光顯微鏡下觀察、攝片。

        ②PI 染色流式細胞儀(FCM)檢測細胞凋亡率 細胞按實驗要求給予不同因素處理后,離心收集細胞,PBS 洗2 次,加入預冷的70%乙醇4 ℃固定過夜。測定前離心棄去乙醇,細胞重懸于含有100 mg/L 碘化丙啶(PI)和2 ×104U/L RNase A 的染色液中,室溫避光染色30 min。流式細胞儀檢測凋亡率(激發(fā)波長:488 nm;發(fā)射波長:610 nm)。每樣本計數(shù)12 000 個細胞,采用熒光強度值并以Multicycle 軟件處理結(jié)果,計算凋亡率。

        ③Caspase-3 活性測定 Caspase-3 的活性測定根據(jù)試劑盒的說明進行,按實驗分組給以不同的處理因素后,離心收集細胞,使用冰冷的PBS 洗滌細胞2次。裂解緩沖液(Tris-HCl 50 mmol/L,pH 7.4,1 mmol/L EDTA,1 mmol/L PMSF,1%Triton X-100)重懸細胞,冰上孵育20min,間以振蕩。細胞裂解物在4 ℃、10 000 ×g 離心5 min,取上清。進行蛋白含量測定。上清內(nèi)加入反應試劑(HEPES 20 mmol/L,DTT 2 mmol/L,10% glycerin,pH 7.5)后,與caspase-3 的底物在37 ℃孵育4 h,405 nm 處測定吸光度值。

        2.3 免疫印記法(Western blotting)檢測HSP70 和HSP90 的表達 經(jīng)實驗因素處理后消化、離心收集細胞。冰冷的PBS 洗滌細胞2 次,再加入裂解緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl,0.2 g/L NaN3,1 g/L SDS,1.0 mmol/L PMSF,5 mg/L aprotinin,1.0 g/L NP40,5.0 g/L 脫氧膽酸鈉,pH 8.0)振蕩混勻,冰浴30 min。離心細胞裂解物(4 ℃12 000×g 離心5 min),取上清保存于-80 ℃。BCA 蛋白定量試劑盒用來進行蛋白定量。調(diào)整樣品的蛋白量進行SDS-PAGE,電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(100 V 真空電轉(zhuǎn)移1 h)。PBST 溶液用來洗膜5 min。室溫下用含5%脫脂奶粉的PBST 溶液封閉PVDF 膜1 h。隨后加入Ⅰ抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。PBST 溶液洗膜3 次,每次5 min。加入相應的Ⅱ抗(1∶1 000),孵育1 h,漂洗3 次,每次5 min。將PVDF 膜用化學發(fā)光試劑ECL 染1 min,暗室中曝光到X 光片上。凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。

        3 統(tǒng)計學處理

        實驗數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計軟件(SPSS 14.0)分析,用均數(shù)±標準差(±s)表示,組間比較用單因素方差分析(Oneway ANOVA)檢驗,用最小有意義差異檢驗(least significant difference,LSD 和SNK)進行均數(shù)間的多重比較,檢驗水準α=0.05。每組實驗均重復3-6 次。

        結(jié) 果

        1 LY294002 拮抗H2O2 預處理的抗細胞凋亡作用

        1.1 凋亡細胞的形態(tài)變化 結(jié)果顯示,正常生長的PC12 細胞的胞核呈現(xiàn)彌散均勻熒光,核無固縮,為體積較大的淺染核形態(tài),見圖1A;300 μmol/L 的H2O2作用12 h 后,細胞核的染色質(zhì)凝集、邊緣化,胞核染色質(zhì)裂解為塊狀,產(chǎn)生凋亡小體等典型的凋亡特征,見圖1B;預處理則明顯減少300 μmol/L H2O2引起細胞凋亡,見圖1C。而在預處理前給予LY294002 則可使凋亡細胞的數(shù)量增加,見圖1D。

        1.2 Caspase-3 活性的變化 300 μmol/L H2O2引起PC12 細胞的caspase-3 活性顯著升高,提示H2O2誘導的凋亡依賴于caspase-3 的活化。H2O2預處理可以明顯降低300 μmol/L H2O2引起的caspase-3 活性升高,而ly294002 可以阻斷H2O2預處理降低caspase-3 活性的作用,見圖2。

        2 Quercetin 和17-AAG 拮抗H2O2 預處理的抗細胞凋亡作用

        2.1 凋亡細胞的形態(tài)變化 Hoechst 33258 染色結(jié)果顯示,在H2O2預處理前分別給予quercetin 和17-AAG,拮抗了H2O2預處理引起的細胞保護作用,使凋亡細胞的數(shù)量增加,見圖3。

        Figure 1. Effect of LY294002 on anti-apoptosis induced by H2O2 preconditioning(Hoechst 33258 staining,×200).The morphological changes of apoptotic cells were assessed by Hoechst 33258 staining. A:untreated cells (control);B:cells treated with 300 μmol/L H2O2 for 12 h;C:cells preconditioned with 100 μmol/L H2O2 for 90 min before treatment with 300 μmol/L H2O2;D:pretreatment with 25 μmol/L LY294002 30 min before H2O2 preconditioning.圖1 LY294002 對H2O2 預處理抗細胞凋亡的影響

        Figure 2. Effect of LY294002 on inhibition of caspase-3 activity induced by H2O2 preconditioning(PC).Caspase-3 activity was detected by colorimetry. PC12 cells were treated with the indicated treatments and divided into 6 groups as previous description. ±s.n =6. ##P <0.01 vs control;**P <0.01 vs H2O2 group;△△P <0.01 vs PC+ H2O2 group.圖2 LY294002 對H2O2 預處理抑制caspase-3 活性的影響

        2.2 細胞凋亡率的變化 流式細胞儀的檢測結(jié)果顯示:PC12 細胞經(jīng)100 μmol/L H2O2預處理后,可使300 μmol/L H2O2引起的細胞凋亡率由(65.5±4.1)%下降至(37.1 ±2.3)%,P <0.01,而在H2O2預處理前分別給予quercetin 和17-AAG,細胞的凋亡率從(37.1±2.3)%上升至(53.6 ±5.2)%和(58.5 ±3.6)%,P <0.01,溶劑(quercetin 和17-AAG 的溶媒)處理沒有誘導細胞凋亡的作用,見圖4。

        3 LY294002 對H2O2 預處理上調(diào)HSP70 和HSP90表達的影響

        Western blotting 結(jié)果顯示,100 μmol/L H2O2和300 μmol/L H2O2均增加細胞內(nèi)HSP70 和HSP90 的表達,但在H2O2損傷前給予預處理能明顯提高細胞內(nèi)HSP70 和HSP90 的表達。而LY294002 抑制了H2O2預處理誘導的HSP70 及HSP90 表達上調(diào),見圖5。

        討 論

        早期的研究發(fā)現(xiàn),適應性細胞保護作用是由預處理因素誘導產(chǎn)生的蛋白質(zhì)所介導,抑制蛋白質(zhì)的合成則消除了這種保護作用[7]。而對預處理因素反應的保護性蛋白質(zhì)的性質(zhì)在很大程度上是未知的。HSP 作為細胞內(nèi)最重要的分子伴侶,除參與細胞內(nèi)一些重要蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象及穩(wěn)定性調(diào)節(jié)之外,另一重要生理功能是對應激狀態(tài)下的細胞提供保護[4,5]。通常認為HSP 可以通過阻斷細胞重要蛋白質(zhì)的變性及聚合而達到保護細胞的作用,但近年來的研究證實HSP 蛋白家族的重要成員如HSP70、HSP90 可以直接作用于細胞的抗凋亡機制,在細胞的抗凋亡反應中起著重要作用[8-10]。

        Figure 3. Effects of quercetin and 17-AAG on anti-apoptosis induced by H2O2 preconditioning(Hoechst 33258 staining,×200).A:untreated cells (control);B:cells treated with 300 μmol/L H2O2 for 12 h;C:cells preconditioned with 100 μmol/L H2O2 for 90 min before treatment with 300 μmol/L H2O2;D:pretreatment with 50 μmol/L quercetin 30 min before H2O2 preconditioning;E:pretreatment with 100 nmol/L 17-AAG 30 min before H2O2 preconditioning;F:cells treated with vehicle.圖3 Quercetin 和17-AAG 對H2O2 預處理抗細胞凋亡的影響

        Figure 4. Effects of quercetin and 17-AAG on anti-apoptosis induced by H2O2 preconditioning(FCM assay). A:untreated cells(control);B:cells treated with 300 μmol/L H2O2 for 12 h;C:cells preconditioned with 100 μmol/L H2O2 for 90 min before treatment with 300 μmol/L H2O2;D:pretreatment with 50 μmol/L quercetin 30 min before H2O2 preconditioning;E:pretreatment with 100 nmol/L 17-AAG 30 min before H2O2 preconditioning;F:cells treated with vehicle. ±s.n=6. **P<0.01 vs H2O2 group;##P <0.01 vs PC+ H2O2 group.圖4 Quercetin 和17-AAG 對H2O2 預處理抗細胞凋亡的影響

        Figure 5. Effect of LY294002 on up-regulation of HSP70 and HSP90 induced by H2O2 preconditioning.The expression of HSP70 and HSP90 were detected by Western blotting. PC12 cells were treated with the indicated treatments and divided into 6 groups as previous description. ±s.n=3. ##P <0.01 vs control;**P <0.01 vs H2O2 group;△△P <0.01 vs PC+ H2O2 group.圖5 LY294002 對H2O2 預處理上調(diào)HSP70 和HSP90 表達的影響

        本課題組最近的研究結(jié)果表明,PI3K/Akt 通路介導了H2O2預處理誘導的適應性細胞保護作用[6]。本研究首先觀察了阻斷PI3K/Akt 通路對H2O2預處理抗凋亡作用的影響。細胞凋亡分析的結(jié)果顯示,高濃度的H2O2誘導細胞凋亡,H2O2預處理使PC12細胞提高對高濃度H2O2的抵抗能力,減少細胞的凋亡。但是在H2O2預處理前使用PI3K/Akt 通路抑制劑LY294002,則拮抗了H2O2預處理誘導的抗細胞凋亡作用。Caspase-3 是凋亡蛋白酶級聯(lián)反應的最終通路,H2O2預處理可以降低高濃度H2O2引起的caspase-3 活性升高,在預處理前使用LY294002 拮抗了這一作用,說明PI3K/Akt 通路介導的H2O2預處理的抗細胞凋亡作用是通過抑制caspase-3 的活性而實現(xiàn)。為了觀察熱休克蛋白在H2O2預處理誘導的抗細胞凋亡中的作用,分別在預處理前使用HSP70 和HSP90 的抑制劑quercetin 和17-AAG。對細胞凋亡的分析顯示,quercetin 和17-AAG 拮抗了H2O2預處理誘導的細胞保護作用,使細胞凋亡增加。

        既然PI3K/Akt 通路和熱休克蛋白均參與了H2O2預處理誘導的細胞保護作用,為了明確HSP 是否參與PI3K/Akt 通路介導的這一抗細胞凋亡作用,在H2O2預處理前給予LY294002,觀察對HSP70 和HSP90 表達的影響。結(jié)果顯示,H2O2(預處理劑量和損傷劑量)均可以引起HSP70 和HSP90 的表達升高,說明在氧化應激情況下,熱休克蛋白的表達增多可能作為機體的一個適應性反應。在高濃度H2O2損傷前給予預處理則明顯增加HSP70 和HSP90 的表達。有意思的是,使用LY294002 能夠明顯抑制H2O2預處理誘導的HSP70 和HSP90 表達上調(diào),表明PI3K/Akt 通路介導了H2O2預處理增加HSP70 和HSP90 表達的作用。

        在面對氧化應激的挑戰(zhàn)中,一些分子信號事件和基因程序可以被激活,最終發(fā)展成為對氧化損傷的抵抗能力。本研究觀察到PI3K/Akt 通路和熱休克蛋白均參與H2O2預處理誘導的細胞保護作用。PI3K/Akt 通路抑制劑LY294002 在拮抗H2O2預處理誘導的抗細胞凋亡作用的同時,也明顯地抑制HSP70 和HSP90 的表達,提示在H2O2預處理誘導的適應性保護反應中,PI3K/Akt 通路的激活促進了HSP70 和HSP90 的表達,而HSP70 和HSP90 作為PI3K/Akt 通路激活后的效應蛋白,參與PI3K/Akt 介導的H2O2預處理的抗細胞凋亡作用。

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