張 梅， 李 衛(wèi)， 郭瑞鮮， 羅健東， 馮鑒強△

(1 廣州醫(yī)學院藥理教研室，廣東 廣州510082;2 暨南大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 廣州510632;3中山大學中山醫(yī)學院生理教研室，廣東 廣州510080)

適應性細胞保護是指某些“亞傷害性”應激預處理可以減輕后續(xù)更嚴重的損害。作為機體維持穩(wěn)態(tài)的天然機制，適應性細胞保護是在不改變攻擊因子性質(zhì)的情況下，通過外源性的適宜刺激(預處理)調(diào)動機體自身的防護機制，加強細胞對損傷的抵抗能力。適應性細胞保護作用的存在為主動防治某些疾病提供了可能。本課題組利用腎上腺嗜鉻細胞瘤(PC12)細胞建立了H2O2預處理誘導的適應性細胞保護模型，以期為防御氧化應激對多巴胺能神經(jīng)元的損傷提供依據(jù)。前期研究表明，H2O2預處理誘導的適應性保護反應通過多種分子機制發(fā)揮抗細胞凋亡作用，涉及到幾條信號通路的激活。其中細胞內(nèi)一氧化氮合酶和環(huán)氧合酶2，以及JAK－STAT 和NF－κB 信號通路的激活均參與了這種適應性保護反應［1－3］。雖然H2O2預處理通過激活相關的分子和信號轉導途徑發(fā)揮其細胞保護作用，但是何種效應蛋白作為這種適應性保護功能的執(zhí)行者卻尚未清楚。熱休克蛋白(heat－shock proteins，HSP)是機體面對多種應激原如熱、活性氧、DNA 損傷、缺血、缺氧、炎癥刺激時，產(chǎn)生的一組能夠結合細胞內(nèi)具有重要功能蛋白的蛋白質(zhì)，它的生理功能之一是對應激狀態(tài)下的細胞提供保護［4，5］。

磷脂酰肌醇3－激酶/Akt (phosphatidylinositol 3－kinase/Akt，PI3K/Akt)信號通路參與多種細胞功能的調(diào)節(jié)，是神經(jīng)元存活的主要途徑之一。我們最近的研究顯示，在PC12 細胞，H2O2預處理可引起Akt 活化，并且PI3K/Akt 通路的激活發(fā)揮了抗細胞凋亡的作用，參與H2O2預處理誘導的適應性保護反應［6］。HSP 作為在眾多應激情況下發(fā)揮保護作用的效應蛋白，是否參與PI3K/Akt 信號通路介導的H2O2預處理誘導的抗細胞凋亡作用，本文擬對此進行探討。

材 料 和 方 法

1 材料

RPMI－1640 培養(yǎng)基購自Gibco－BRL，小牛血清購自HyClone。30% H2O2為Alfa Aesar 產(chǎn)品。Hoechst33258、胰蛋白酶、BSA、HEPES、EDTA、DMSO、碘化丙啶(propidium iodide，PI)、槲皮素(quercetin)、17－烯丙氨基－17－脫甲氧基格爾德霉素(17－allylamino－17－demethoxygeldanamycin，17－AAG)和LY294002 均購自Sigma。HSP70、HSP90 抗體和化學發(fā)光試劑盒(Amersham ECL Kit)購自Cell Signaling Technology (CST);β－actin 及HRP 標記的Ⅱ抗為Santa Cruz 產(chǎn)品。BCA 蛋白定量試劑盒購自Pierce。Caspase－3 活性測定試劑盒為德國默克產(chǎn)品。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)和預處理方法 PC12 細胞由中山大學實驗動物中心提供。于37 ℃、5%CO2的條件下，用含10%馬血清和5%胎牛血清的RPMI－1640 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。H2O2預處理的實施方法如下:100 μmol/L H2O2作用PC12 細胞90 min 后，撤去H2O2，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h，再給予300 μmol/L H2O2作用12 h。PI3K 抑制劑LY294002(25 μmol/L)、HSP70 抑制劑quercetin(50μmol/L)和HSP90 抑制劑17－AAG(100 nmol/L)分別在預處理前30 min 加入培養(yǎng)液。

2.2 細胞凋亡的檢測

①Hoechst33258 染色觀察細胞凋亡形態(tài)變化 細胞接種于培養(yǎng)板內(nèi)，按實驗要求給以不同的處理因素，處理終止后棄去培養(yǎng)液，細胞用PBS 洗2 次，加入新鮮配制的4%多聚甲醛，4 ℃固定細胞10 min，PBS 沖洗1 次，加5 mg/L Hoechst 33258 避光染色10 min，PBS 沖洗2 次，熒光顯微鏡下觀察、攝片。

②PI 染色流式細胞儀(FCM)檢測細胞凋亡率 細胞按實驗要求給予不同因素處理后，離心收集細胞，PBS 洗2 次，加入預冷的70%乙醇4 ℃固定過夜。測定前離心棄去乙醇，細胞重懸于含有100 mg/L 碘化丙啶(PI)和2 ×104U/L RNase A 的染色液中，室溫避光染色30 min。流式細胞儀檢測凋亡率(激發(fā)波長:488 nm;發(fā)射波長:610 nm)。每樣本計數(shù)12 000 個細胞，采用熒光強度值并以Multicycle 軟件處理結果，計算凋亡率。

③Caspase－3 活性測定 Caspase－3 的活性測定根據(jù)試劑盒的說明進行，按實驗分組給以不同的處理因素后，離心收集細胞，使用冰冷的PBS 洗滌細胞2次。裂解緩沖液(Tris－HCl 50 mmol/L，pH 7.4，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，1%Triton X－100)重懸細胞，冰上孵育20min，間以振蕩。細胞裂解物在4 ℃、10 000 ×g 離心5 min，取上清。進行蛋白含量測定。上清內(nèi)加入反應試劑(HEPES 20 mmol/L，DTT 2 mmol/L，10% glycerin，pH 7.5)后，與caspase－3 的底物在37 ℃孵育4 h，405 nm 處測定吸光度值。

2.3 免疫印記法(Western blotting)檢測HSP70 和HSP90 的表達 經(jīng)實驗因素處理后消化、離心收集細胞。冰冷的PBS 洗滌細胞2 次，再加入裂解緩沖液(50 mmol/L Tris－HCl，150 mmol/L NaCl，0.2 g/L NaN3，1 g/L SDS，1.0 mmol/L PMSF，5 mg/L aprotinin，1.0 g/L NP40，5.0 g/L 脫氧膽酸鈉，pH 8.0)振蕩混勻，冰浴30 min。離心細胞裂解物(4 ℃12 000×g 離心5 min)，取上清保存于－80 ℃。BCA 蛋白定量試劑盒用來進行蛋白定量。調(diào)整樣品的蛋白量進行SDS－PAGE，電泳分離后的蛋白轉移到PVDF膜上(100 V 真空電轉移1 h)。PBST 溶液用來洗膜5 min。室溫下用含5%脫脂奶粉的PBST 溶液封閉PVDF 膜1 h。隨后加入Ⅰ抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。PBST 溶液洗膜3 次，每次5 min。加入相應的Ⅱ抗(1∶1 000)，孵育1 h，漂洗3 次，每次5 min。將PVDF 膜用化學發(fā)光試劑ECL 染1 min，暗室中曝光到X 光片上。凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結果。

3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計軟件(SPSS 14.0)分析，用均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較用單因素方差分析(Oneway ANOVA)檢驗，用最小有意義差異檢驗(least significant difference，LSD 和SNK)進行均數(shù)間的多重比較，檢驗水準α=0.05。每組實驗均重復3－6 次。

結 果

1 LY294002 拮抗H2O2 預處理的抗細胞凋亡作用

1.1 凋亡細胞的形態(tài)變化 結果顯示，正常生長的PC12 細胞的胞核呈現(xiàn)彌散均勻熒光，核無固縮，為體積較大的淺染核形態(tài)，見圖1A;300 μmol/L 的H2O2作用12 h 后，細胞核的染色質(zhì)凝集、邊緣化，胞核染色質(zhì)裂解為塊狀，產(chǎn)生凋亡小體等典型的凋亡特征，見圖1B;預處理則明顯減少300 μmol/L H2O2引起細胞凋亡，見圖1C。而在預處理前給予LY294002 則可使凋亡細胞的數(shù)量增加，見圖1D。

1.2 Caspase－3 活性的變化 300 μmol/L H2O2引起PC12 細胞的caspase－3 活性顯著升高，提示H2O2誘導的凋亡依賴于caspase－3 的活化。H2O2預處理可以明顯降低300 μmol/L H2O2引起的caspase－3 活性升高，而ly294002 可以阻斷H2O2預處理降低caspase－3 活性的作用，見圖2。

2 Quercetin 和17－AAG 拮抗H2O2 預處理的抗細胞凋亡作用

2.1 凋亡細胞的形態(tài)變化 Hoechst 33258 染色結果顯示，在H2O2預處理前分別給予quercetin 和17－AAG，拮抗了H2O2預處理引起的細胞保護作用，使凋亡細胞的數(shù)量增加，見圖3。

Figure 1. Effect of LY294002 on anti－apoptosis induced by H2O2 preconditioning(Hoechst 33258 staining，×200).The morphological changes of apoptotic cells were assessed by Hoechst 33258 staining. A:untreated cells (control);B:cells treated with 300 μmol/L H2O2 for 12 h;C:cells preconditioned with 100 μmol/L H2O2 for 90 min before treatment with 300 μmol/L H2O2;D:pretreatment with 25 μmol/L LY294002 30 min before H2O2 preconditioning.圖1 LY294002 對H2O2 預處理抗細胞凋亡的影響

Figure 2. Effect of LY294002 on inhibition of caspase－3 activity induced by H2O2 preconditioning(PC).Caspase－3 activity was detected by colorimetry. PC12 cells were treated with the indicated treatments and divided into 6 groups as previous description. ±s.n =6. ##P ＜0.01 vs control;＊＊P ＜0.01 vs H2O2 group;△△P ＜0.01 vs PC+ H2O2 group.圖2 LY294002 對H2O2 預處理抑制caspase－3 活性的影響

2.2 細胞凋亡率的變化 流式細胞儀的檢測結果顯示:PC12 細胞經(jīng)100 μmol/L H2O2預處理后，可使300 μmol/L H2O2引起的細胞凋亡率由(65.5±4.1)%下降至(37.1 ±2.3)%，P ＜0.01，而在H2O2預處理前分別給予quercetin 和17－AAG，細胞的凋亡率從(37.1±2.3)%上升至(53.6 ±5.2)%和(58.5 ±3.6)%，P ＜0.01，溶劑(quercetin 和17－AAG 的溶媒)處理沒有誘導細胞凋亡的作用，見圖4。

3 LY294002 對H2O2 預處理上調(diào)HSP70 和HSP90表達的影響

Western blotting 結果顯示，100 μmol/L H2O2和300 μmol/L H2O2均增加細胞內(nèi)HSP70 和HSP90 的表達，但在H2O2損傷前給予預處理能明顯提高細胞內(nèi)HSP70 和HSP90 的表達。而LY294002 抑制了H2O2預處理誘導的HSP70 及HSP90 表達上調(diào)，見圖5。

討 論

早期的研究發(fā)現(xiàn)，適應性細胞保護作用是由預處理因素誘導產(chǎn)生的蛋白質(zhì)所介導，抑制蛋白質(zhì)的合成則消除了這種保護作用［7］。而對預處理因素反應的保護性蛋白質(zhì)的性質(zhì)在很大程度上是未知的。HSP 作為細胞內(nèi)最重要的分子伴侶，除參與細胞內(nèi)一些重要蛋白質(zhì)分子的構象及穩(wěn)定性調(diào)節(jié)之外，另一重要生理功能是對應激狀態(tài)下的細胞提供保護［4，5］。通常認為HSP 可以通過阻斷細胞重要蛋白質(zhì)的變性及聚合而達到保護細胞的作用，但近年來的研究證實HSP 蛋白家族的重要成員如HSP70、HSP90 可以直接作用于細胞的抗凋亡機制，在細胞的抗凋亡反應中起著重要作用［8－10］。

Figure 3. Effects of quercetin and 17－AAG on anti－apoptosis induced by H2O2 preconditioning(Hoechst 33258 staining，×200).A:untreated cells (control);B:cells treated with 300 μmol/L H2O2 for 12 h;C:cells preconditioned with 100 μmol/L H2O2 for 90 min before treatment with 300 μmol/L H2O2;D:pretreatment with 50 μmol/L quercetin 30 min before H2O2 preconditioning;E:pretreatment with 100 nmol/L 17－AAG 30 min before H2O2 preconditioning;F:cells treated with vehicle.圖3 Quercetin 和17－AAG 對H2O2 預處理抗細胞凋亡的影響

Figure 4. Effects of quercetin and 17－AAG on anti－apoptosis induced by H2O2 preconditioning(FCM assay). A:untreated cells(control);B:cells treated with 300 μmol/L H2O2 for 12 h;C:cells preconditioned with 100 μmol/L H2O2 for 90 min before treatment with 300 μmol/L H2O2;D:pretreatment with 50 μmol/L quercetin 30 min before H2O2 preconditioning;E:pretreatment with 100 nmol/L 17－AAG 30 min before H2O2 preconditioning;F:cells treated with vehicle. ±s.n=6. ＊＊P＜0.01 vs H2O2 group;##P ＜0.01 vs PC+ H2O2 group.圖4 Quercetin 和17－AAG 對H2O2 預處理抗細胞凋亡的影響

Figure 5. Effect of LY294002 on up－regulation of HSP70 and HSP90 induced by H2O2 preconditioning.The expression of HSP70 and HSP90 were detected by Western blotting. PC12 cells were treated with the indicated treatments and divided into 6 groups as previous description. ±s.n=3. ##P ＜0.01 vs control;＊＊P ＜0.01 vs H2O2 group;△△P ＜0.01 vs PC+ H2O2 group.圖5 LY294002 對H2O2 預處理上調(diào)HSP70 和HSP90 表達的影響

本課題組最近的研究結果表明，PI3K/Akt 通路介導了H2O2預處理誘導的適應性細胞保護作用［6］。本研究首先觀察了阻斷PI3K/Akt 通路對H2O2預處理抗凋亡作用的影響。細胞凋亡分析的結果顯示，高濃度的H2O2誘導細胞凋亡，H2O2預處理使PC12細胞提高對高濃度H2O2的抵抗能力，減少細胞的凋亡。但是在H2O2預處理前使用PI3K/Akt 通路抑制劑LY294002，則拮抗了H2O2預處理誘導的抗細胞凋亡作用。Caspase－3 是凋亡蛋白酶級聯(lián)反應的最終通路，H2O2預處理可以降低高濃度H2O2引起的caspase－3 活性升高，在預處理前使用LY294002 拮抗了這一作用，說明PI3K/Akt 通路介導的H2O2預處理的抗細胞凋亡作用是通過抑制caspase－3 的活性而實現(xiàn)。為了觀察熱休克蛋白在H2O2預處理誘導的抗細胞凋亡中的作用，分別在預處理前使用HSP70 和HSP90 的抑制劑quercetin 和17－AAG。對細胞凋亡的分析顯示，quercetin 和17－AAG 拮抗了H2O2預處理誘導的細胞保護作用，使細胞凋亡增加。

既然PI3K/Akt 通路和熱休克蛋白均參與了H2O2預處理誘導的細胞保護作用，為了明確HSP 是否參與PI3K/Akt 通路介導的這一抗細胞凋亡作用，在H2O2預處理前給予LY294002，觀察對HSP70 和HSP90 表達的影響。結果顯示，H2O2(預處理劑量和損傷劑量)均可以引起HSP70 和HSP90 的表達升高，說明在氧化應激情況下，熱休克蛋白的表達增多可能作為機體的一個適應性反應。在高濃度H2O2損傷前給予預處理則明顯增加HSP70 和HSP90 的表達。有意思的是，使用LY294002 能夠明顯抑制H2O2預處理誘導的HSP70 和HSP90 表達上調(diào)，表明PI3K/Akt 通路介導了H2O2預處理增加HSP70 和HSP90 表達的作用。

在面對氧化應激的挑戰(zhàn)中，一些分子信號事件和基因程序可以被激活，最終發(fā)展成為對氧化損傷的抵抗能力。本研究觀察到PI3K/Akt 通路和熱休克蛋白均參與H2O2預處理誘導的細胞保護作用。PI3K/Akt 通路抑制劑LY294002 在拮抗H2O2預處理誘導的抗細胞凋亡作用的同時，也明顯地抑制HSP70 和HSP90 的表達，提示在H2O2預處理誘導的適應性保護反應中，PI3K/Akt 通路的激活促進了HSP70 和HSP90 的表達，而HSP70 和HSP90 作為PI3K/Akt 通路激活后的效應蛋白，參與PI3K/Akt 介導的H2O2預處理的抗細胞凋亡作用。

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