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        熱休克蛋白參與PI3K/Akt介導(dǎo)H2O2預(yù)處理的抗凋亡作用*

        2011-12-23 04:07:46郭瑞鮮羅健東馮鑒強(qiáng)
        中國(guó)病理生理雜志 2011年8期
        關(guān)鍵詞:適應(yīng)性預(yù)處理通路

        張 梅, 李 衛(wèi), 郭瑞鮮, 羅健東, 馮鑒強(qiáng)△

        (1 廣州醫(yī)學(xué)院藥理教研室,廣東 廣州510082;2 暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科,廣東 廣州510632;3中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院生理教研室,廣東 廣州510080)

        適應(yīng)性細(xì)胞保護(hù)是指某些“亞傷害性”應(yīng)激預(yù)處理可以減輕后續(xù)更嚴(yán)重的損害。作為機(jī)體維持穩(wěn)態(tài)的天然機(jī)制,適應(yīng)性細(xì)胞保護(hù)是在不改變攻擊因子性質(zhì)的情況下,通過(guò)外源性的適宜刺激(預(yù)處理)調(diào)動(dòng)機(jī)體自身的防護(hù)機(jī)制,加強(qiáng)細(xì)胞對(duì)損傷的抵抗能力。適應(yīng)性細(xì)胞保護(hù)作用的存在為主動(dòng)防治某些疾病提供了可能。本課題組利用腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤(PC12)細(xì)胞建立了H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)的適應(yīng)性細(xì)胞保護(hù)模型,以期為防御氧化應(yīng)激對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的損傷提供依據(jù)。前期研究表明,H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)的適應(yīng)性保護(hù)反應(yīng)通過(guò)多種分子機(jī)制發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用,涉及到幾條信號(hào)通路的激活。其中細(xì)胞內(nèi)一氧化氮合酶和環(huán)氧合酶2,以及JAK-STAT 和NF-κB 信號(hào)通路的激活均參與了這種適應(yīng)性保護(hù)反應(yīng)[1-3]。雖然H2O2預(yù)處理通過(guò)激活相關(guān)的分子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮其細(xì)胞保護(hù)作用,但是何種效應(yīng)蛋白作為這種適應(yīng)性保護(hù)功能的執(zhí)行者卻尚未清楚。熱休克蛋白(heat-shock proteins,HSP)是機(jī)體面對(duì)多種應(yīng)激原如熱、活性氧、DNA 損傷、缺血、缺氧、炎癥刺激時(shí),產(chǎn)生的一組能夠結(jié)合細(xì)胞內(nèi)具有重要功能蛋白的蛋白質(zhì),它的生理功能之一是對(duì)應(yīng)激狀態(tài)下的細(xì)胞提供保護(hù)[4,5]。

        磷脂酰肌醇3-激酶/Akt (phosphatidylinositol 3-kinase/Akt,PI3K/Akt)信號(hào)通路參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié),是神經(jīng)元存活的主要途徑之一。我們最近的研究顯示,在PC12 細(xì)胞,H2O2預(yù)處理可引起Akt 活化,并且PI3K/Akt 通路的激活發(fā)揮了抗細(xì)胞凋亡的作用,參與H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)的適應(yīng)性保護(hù)反應(yīng)[6]。HSP 作為在眾多應(yīng)激情況下發(fā)揮保護(hù)作用的效應(yīng)蛋白,是否參與PI3K/Akt 信號(hào)通路介導(dǎo)的H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)的抗細(xì)胞凋亡作用,本文擬對(duì)此進(jìn)行探討。

        材 料 和 方 法

        1 材料

        RPMI-1640 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco-BRL,小牛血清購(gòu)自HyClone。30% H2O2為Alfa Aesar 產(chǎn)品。Hoechst33258、胰蛋白酶、BSA、HEPES、EDTA、DMSO、碘化丙啶(propidium iodide,PI)、槲皮素(quercetin)、17-烯丙氨基-17-脫甲氧基格爾德霉素(17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin,17-AAG)和LY294002 均購(gòu)自Sigma。HSP70、HSP90 抗體和化學(xué)發(fā)光試劑盒(Amersham ECL Kit)購(gòu)自Cell Signaling Technology (CST);β-actin 及HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗為Santa Cruz 產(chǎn)品。BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自Pierce。Caspase-3 活性測(cè)定試劑盒為德國(guó)默克產(chǎn)品。

        2 方法

        2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和預(yù)處理方法 PC12 細(xì)胞由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。于37 ℃、5%CO2的條件下,用含10%馬血清和5%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。H2O2預(yù)處理的實(shí)施方法如下:100 μmol/L H2O2作用PC12 細(xì)胞90 min 后,撤去H2O2,繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h,再給予300 μmol/L H2O2作用12 h。PI3K 抑制劑LY294002(25 μmol/L)、HSP70 抑制劑quercetin(50μmol/L)和HSP90 抑制劑17-AAG(100 nmol/L)分別在預(yù)處理前30 min 加入培養(yǎng)液。

        2.2 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

        ①Hoechst33258 染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)變化 細(xì)胞接種于培養(yǎng)板內(nèi),按實(shí)驗(yàn)要求給以不同的處理因素,處理終止后棄去培養(yǎng)液,細(xì)胞用PBS 洗2 次,加入新鮮配制的4%多聚甲醛,4 ℃固定細(xì)胞10 min,PBS 沖洗1 次,加5 mg/L Hoechst 33258 避光染色10 min,PBS 沖洗2 次,熒光顯微鏡下觀察、攝片。

        ②PI 染色流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)要求給予不同因素處理后,離心收集細(xì)胞,PBS 洗2 次,加入預(yù)冷的70%乙醇4 ℃固定過(guò)夜。測(cè)定前離心棄去乙醇,細(xì)胞重懸于含有100 mg/L 碘化丙啶(PI)和2 ×104U/L RNase A 的染色液中,室溫避光染色30 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率(激發(fā)波長(zhǎng):488 nm;發(fā)射波長(zhǎng):610 nm)。每樣本計(jì)數(shù)12 000 個(gè)細(xì)胞,采用熒光強(qiáng)度值并以Multicycle 軟件處理結(jié)果,計(jì)算凋亡率。

        ③Caspase-3 活性測(cè)定 Caspase-3 的活性測(cè)定根據(jù)試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行,按實(shí)驗(yàn)分組給以不同的處理因素后,離心收集細(xì)胞,使用冰冷的PBS 洗滌細(xì)胞2次。裂解緩沖液(Tris-HCl 50 mmol/L,pH 7.4,1 mmol/L EDTA,1 mmol/L PMSF,1%Triton X-100)重懸細(xì)胞,冰上孵育20min,間以振蕩。細(xì)胞裂解物在4 ℃、10 000 ×g 離心5 min,取上清。進(jìn)行蛋白含量測(cè)定。上清內(nèi)加入反應(yīng)試劑(HEPES 20 mmol/L,DTT 2 mmol/L,10% glycerin,pH 7.5)后,與caspase-3 的底物在37 ℃孵育4 h,405 nm 處測(cè)定吸光度值。

        2.3 免疫印記法(Western blotting)檢測(cè)HSP70 和HSP90 的表達(dá) 經(jīng)實(shí)驗(yàn)因素處理后消化、離心收集細(xì)胞。冰冷的PBS 洗滌細(xì)胞2 次,再加入裂解緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl,0.2 g/L NaN3,1 g/L SDS,1.0 mmol/L PMSF,5 mg/L aprotinin,1.0 g/L NP40,5.0 g/L 脫氧膽酸鈉,pH 8.0)振蕩混勻,冰浴30 min。離心細(xì)胞裂解物(4 ℃12 000×g 離心5 min),取上清保存于-80 ℃。BCA 蛋白定量試劑盒用來(lái)進(jìn)行蛋白定量。調(diào)整樣品的蛋白量進(jìn)行SDS-PAGE,電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(100 V 真空電轉(zhuǎn)移1 h)。PBST 溶液用來(lái)洗膜5 min。室溫下用含5%脫脂奶粉的PBST 溶液封閉PVDF 膜1 h。隨后加入Ⅰ抗(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜。PBST 溶液洗膜3 次,每次5 min。加入相應(yīng)的Ⅱ抗(1∶1 000),孵育1 h,漂洗3 次,每次5 min。將PVDF 膜用化學(xué)發(fā)光試劑ECL 染1 min,暗室中曝光到X 光片上。凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。

        3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS 14.0)分析,用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較用單因素方差分析(Oneway ANOVA)檢驗(yàn),用最小有意義差異檢驗(yàn)(least significant difference,LSD 和SNK)進(jìn)行均數(shù)間的多重比較,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3-6 次。

        結(jié) 果

        1 LY294002 拮抗H2O2 預(yù)處理的抗細(xì)胞凋亡作用

        1.1 凋亡細(xì)胞的形態(tài)變化 結(jié)果顯示,正常生長(zhǎng)的PC12 細(xì)胞的胞核呈現(xiàn)彌散均勻熒光,核無(wú)固縮,為體積較大的淺染核形態(tài),見(jiàn)圖1A;300 μmol/L 的H2O2作用12 h 后,細(xì)胞核的染色質(zhì)凝集、邊緣化,胞核染色質(zhì)裂解為塊狀,產(chǎn)生凋亡小體等典型的凋亡特征,見(jiàn)圖1B;預(yù)處理則明顯減少300 μmol/L H2O2引起細(xì)胞凋亡,見(jiàn)圖1C。而在預(yù)處理前給予LY294002 則可使凋亡細(xì)胞的數(shù)量增加,見(jiàn)圖1D。

        1.2 Caspase-3 活性的變化 300 μmol/L H2O2引起PC12 細(xì)胞的caspase-3 活性顯著升高,提示H2O2誘導(dǎo)的凋亡依賴于caspase-3 的活化。H2O2預(yù)處理可以明顯降低300 μmol/L H2O2引起的caspase-3 活性升高,而ly294002 可以阻斷H2O2預(yù)處理降低caspase-3 活性的作用,見(jiàn)圖2。

        2 Quercetin 和17-AAG 拮抗H2O2 預(yù)處理的抗細(xì)胞凋亡作用

        2.1 凋亡細(xì)胞的形態(tài)變化 Hoechst 33258 染色結(jié)果顯示,在H2O2預(yù)處理前分別給予quercetin 和17-AAG,拮抗了H2O2預(yù)處理引起的細(xì)胞保護(hù)作用,使凋亡細(xì)胞的數(shù)量增加,見(jiàn)圖3。

        Figure 1. Effect of LY294002 on anti-apoptosis induced by H2O2 preconditioning(Hoechst 33258 staining,×200).The morphological changes of apoptotic cells were assessed by Hoechst 33258 staining. A:untreated cells (control);B:cells treated with 300 μmol/L H2O2 for 12 h;C:cells preconditioned with 100 μmol/L H2O2 for 90 min before treatment with 300 μmol/L H2O2;D:pretreatment with 25 μmol/L LY294002 30 min before H2O2 preconditioning.圖1 LY294002 對(duì)H2O2 預(yù)處理抗細(xì)胞凋亡的影響

        Figure 2. Effect of LY294002 on inhibition of caspase-3 activity induced by H2O2 preconditioning(PC).Caspase-3 activity was detected by colorimetry. PC12 cells were treated with the indicated treatments and divided into 6 groups as previous description. ±s.n =6. ##P <0.01 vs control;**P <0.01 vs H2O2 group;△△P <0.01 vs PC+ H2O2 group.圖2 LY294002 對(duì)H2O2 預(yù)處理抑制caspase-3 活性的影響

        2.2 細(xì)胞凋亡率的變化 流式細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果顯示:PC12 細(xì)胞經(jīng)100 μmol/L H2O2預(yù)處理后,可使300 μmol/L H2O2引起的細(xì)胞凋亡率由(65.5±4.1)%下降至(37.1 ±2.3)%,P <0.01,而在H2O2預(yù)處理前分別給予quercetin 和17-AAG,細(xì)胞的凋亡率從(37.1±2.3)%上升至(53.6 ±5.2)%和(58.5 ±3.6)%,P <0.01,溶劑(quercetin 和17-AAG 的溶媒)處理沒(méi)有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用,見(jiàn)圖4。

        3 LY294002 對(duì)H2O2 預(yù)處理上調(diào)HSP70 和HSP90表達(dá)的影響

        Western blotting 結(jié)果顯示,100 μmol/L H2O2和300 μmol/L H2O2均增加細(xì)胞內(nèi)HSP70 和HSP90 的表達(dá),但在H2O2損傷前給予預(yù)處理能明顯提高細(xì)胞內(nèi)HSP70 和HSP90 的表達(dá)。而LY294002 抑制了H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)的HSP70 及HSP90 表達(dá)上調(diào),見(jiàn)圖5。

        討 論

        早期的研究發(fā)現(xiàn),適應(yīng)性細(xì)胞保護(hù)作用是由預(yù)處理因素誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)所介導(dǎo),抑制蛋白質(zhì)的合成則消除了這種保護(hù)作用[7]。而對(duì)預(yù)處理因素反應(yīng)的保護(hù)性蛋白質(zhì)的性質(zhì)在很大程度上是未知的。HSP 作為細(xì)胞內(nèi)最重要的分子伴侶,除參與細(xì)胞內(nèi)一些重要蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象及穩(wěn)定性調(diào)節(jié)之外,另一重要生理功能是對(duì)應(yīng)激狀態(tài)下的細(xì)胞提供保護(hù)[4,5]。通常認(rèn)為HSP 可以通過(guò)阻斷細(xì)胞重要蛋白質(zhì)的變性及聚合而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的作用,但近年來(lái)的研究證實(shí)HSP 蛋白家族的重要成員如HSP70、HSP90 可以直接作用于細(xì)胞的抗凋亡機(jī)制,在細(xì)胞的抗凋亡反應(yīng)中起著重要作用[8-10]。

        Figure 3. Effects of quercetin and 17-AAG on anti-apoptosis induced by H2O2 preconditioning(Hoechst 33258 staining,×200).A:untreated cells (control);B:cells treated with 300 μmol/L H2O2 for 12 h;C:cells preconditioned with 100 μmol/L H2O2 for 90 min before treatment with 300 μmol/L H2O2;D:pretreatment with 50 μmol/L quercetin 30 min before H2O2 preconditioning;E:pretreatment with 100 nmol/L 17-AAG 30 min before H2O2 preconditioning;F:cells treated with vehicle.圖3 Quercetin 和17-AAG 對(duì)H2O2 預(yù)處理抗細(xì)胞凋亡的影響

        Figure 4. Effects of quercetin and 17-AAG on anti-apoptosis induced by H2O2 preconditioning(FCM assay). A:untreated cells(control);B:cells treated with 300 μmol/L H2O2 for 12 h;C:cells preconditioned with 100 μmol/L H2O2 for 90 min before treatment with 300 μmol/L H2O2;D:pretreatment with 50 μmol/L quercetin 30 min before H2O2 preconditioning;E:pretreatment with 100 nmol/L 17-AAG 30 min before H2O2 preconditioning;F:cells treated with vehicle. ±s.n=6. **P<0.01 vs H2O2 group;##P <0.01 vs PC+ H2O2 group.圖4 Quercetin 和17-AAG 對(duì)H2O2 預(yù)處理抗細(xì)胞凋亡的影響

        Figure 5. Effect of LY294002 on up-regulation of HSP70 and HSP90 induced by H2O2 preconditioning.The expression of HSP70 and HSP90 were detected by Western blotting. PC12 cells were treated with the indicated treatments and divided into 6 groups as previous description. ±s.n=3. ##P <0.01 vs control;**P <0.01 vs H2O2 group;△△P <0.01 vs PC+ H2O2 group.圖5 LY294002 對(duì)H2O2 預(yù)處理上調(diào)HSP70 和HSP90 表達(dá)的影響

        本課題組最近的研究結(jié)果表明,PI3K/Akt 通路介導(dǎo)了H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)的適應(yīng)性細(xì)胞保護(hù)作用[6]。本研究首先觀察了阻斷PI3K/Akt 通路對(duì)H2O2預(yù)處理抗凋亡作用的影響。細(xì)胞凋亡分析的結(jié)果顯示,高濃度的H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,H2O2預(yù)處理使PC12細(xì)胞提高對(duì)高濃度H2O2的抵抗能力,減少細(xì)胞的凋亡。但是在H2O2預(yù)處理前使用PI3K/Akt 通路抑制劑LY294002,則拮抗了H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)的抗細(xì)胞凋亡作用。Caspase-3 是凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的最終通路,H2O2預(yù)處理可以降低高濃度H2O2引起的caspase-3 活性升高,在預(yù)處理前使用LY294002 拮抗了這一作用,說(shuō)明PI3K/Akt 通路介導(dǎo)的H2O2預(yù)處理的抗細(xì)胞凋亡作用是通過(guò)抑制caspase-3 的活性而實(shí)現(xiàn)。為了觀察熱休克蛋白在H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)的抗細(xì)胞凋亡中的作用,分別在預(yù)處理前使用HSP70 和HSP90 的抑制劑quercetin 和17-AAG。對(duì)細(xì)胞凋亡的分析顯示,quercetin 和17-AAG 拮抗了H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用,使細(xì)胞凋亡增加。

        既然PI3K/Akt 通路和熱休克蛋白均參與了H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用,為了明確HSP 是否參與PI3K/Akt 通路介導(dǎo)的這一抗細(xì)胞凋亡作用,在H2O2預(yù)處理前給予LY294002,觀察對(duì)HSP70 和HSP90 表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,H2O2(預(yù)處理劑量和損傷劑量)均可以引起HSP70 和HSP90 的表達(dá)升高,說(shuō)明在氧化應(yīng)激情況下,熱休克蛋白的表達(dá)增多可能作為機(jī)體的一個(gè)適應(yīng)性反應(yīng)。在高濃度H2O2損傷前給予預(yù)處理則明顯增加HSP70 和HSP90 的表達(dá)。有意思的是,使用LY294002 能夠明顯抑制H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)的HSP70 和HSP90 表達(dá)上調(diào),表明PI3K/Akt 通路介導(dǎo)了H2O2預(yù)處理增加HSP70 和HSP90 表達(dá)的作用。

        在面對(duì)氧化應(yīng)激的挑戰(zhàn)中,一些分子信號(hào)事件和基因程序可以被激活,最終發(fā)展成為對(duì)氧化損傷的抵抗能力。本研究觀察到PI3K/Akt 通路和熱休克蛋白均參與H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用。PI3K/Akt 通路抑制劑LY294002 在拮抗H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)的抗細(xì)胞凋亡作用的同時(shí),也明顯地抑制HSP70 和HSP90 的表達(dá),提示在H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)的適應(yīng)性保護(hù)反應(yīng)中,PI3K/Akt 通路的激活促進(jìn)了HSP70 和HSP90 的表達(dá),而HSP70 和HSP90 作為PI3K/Akt 通路激活后的效應(yīng)蛋白,參與PI3K/Akt 介導(dǎo)的H2O2預(yù)處理的抗細(xì)胞凋亡作用。

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