潘麗華， 秦曉同， 朱健華， 桂 樂(lè)

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，江蘇 南通226001)

據(jù)統(tǒng)計(jì)，心力衰竭(heart failure，HF)的年死亡率為10%，是導(dǎo)致65 歲以上的老年人入院的主要原因［1］。心衰的確切病因至今仍不十分明確，大量研究結(jié)果顯示心衰時(shí)循環(huán)內(nèi)分泌激活，主要是腎素-血管緊張素(angiotensin，Ang)-醛固酮系統(tǒng)的激活可加速心力衰竭的惡化［2］。交感神經(jīng)興奮增強(qiáng)是慢性心衰的重要病理特征，其可導(dǎo)致外周血管阻力的增加，增加心臟的后負(fù)荷，腎上腺皮質(zhì)醛固酮釋放增加，水鈉潴留，從而增加心臟的前負(fù)荷。因此，降低心衰狀態(tài)下交感神經(jīng)的活性可以明顯降低心衰的死亡率。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，阻斷腦內(nèi)血管緊張素系統(tǒng)的活性能導(dǎo)致慢性心衰交感神經(jīng)興奮性顯著降低［3］。下丘腦室旁核是心血管系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)的重要區(qū)域，其調(diào)節(jié)了交感神經(jīng)活動(dòng)的輸出，它與大腦其它神經(jīng)核團(tuán)存在密切聯(lián)系，包括延髓頭端腹外側(cè)區(qū)(rostral ventrolateral medulla，RVLM)、孤束核(nucleus tractus solitarius，NTS)、腦橋的藍(lán)斑核(locuscoeruleus，LC)等，這些區(qū)域?qū)π难芟到y(tǒng)起著重要的調(diào)節(jié)作用［4］。本研究制作大鼠心梗后心衰模型，后腹膜途徑尋找腎交感神經(jīng)，利用AngⅡ-1 型(angiotensin Ⅱtype 1，AT1)和2 型(angiotensi Ⅱtype 2，AT2)受體阻滯劑微量注射于下丘腦室旁核，記錄心率、血壓和腎交感神經(jīng)的活性，探討慢性心衰的中樞調(diào)控機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物和儀器

選用SD 大鼠，雄性，體重180 -220 g，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)室分籠飼養(yǎng)，予以標(biāo)準(zhǔn)鼠糧和自來(lái)水，保持籠內(nèi)通風(fēng)干燥，室溫18 -22 ℃。SD 大鼠隨機(jī)分為2 大組:手術(shù)組(HF AT1組、HF AT2組、HF Veh 組)和假手術(shù)組(sham AT1組，sham AT2組、sham Veh 組)。4 周后采用Stoelting 大鼠腦立體定位儀進(jìn)行定位，POWERLAB 8/30 系統(tǒng)采集信號(hào)(Adinstrument)系統(tǒng)記錄心率、血壓和腎交感神經(jīng)放電信號(hào)。

2 試劑

AT1受體阻滯劑(L - 158809)和AT2受體阻滯劑(PD123319)均購(gòu)自 Sigma，用生理鹽水溶解、配制為0.1 mol/L的溶液。人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)［pH 7.4，含有(mmol/L):NaCl 130，KCl 2. 99，CaCl20.98，MgCl2·6H2O 0. 80，NaHCO325，Na2HPO4·12H2O 0.039，Na2HPO4·2H2O 0.46］［5］，- 20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

3 心衰模型的制作

冠脈結(jié)扎誘導(dǎo)慢性心衰動(dòng)物模型:SD 大鼠在水合氯醛麻醉下仰位固定于手術(shù)臺(tái)，自左側(cè)3 -4 肋間開(kāi)胸，暴露心臟，于肺動(dòng)脈圓錐及左心房之間找出冠脈左前降支，以0 號(hào)線(xiàn)立即結(jié)扎冠脈，迅速關(guān)閉胸腔，并用負(fù)壓吸引吸出胸腔內(nèi)血液和氣體。假手術(shù)組僅置縫線(xiàn)而不結(jié)扎冠脈。術(shù)后肌注青霉素。術(shù)后第4 周末對(duì)假手術(shù)組大鼠與心衰組大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

4 血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)

使用烏拉坦麻醉各手術(shù)大鼠，行頸部切口并分離右頸總動(dòng)脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，用動(dòng)脈夾夾住近心端，在管壁上剪一很小的斜口，插入內(nèi)徑0.5 mm、外徑1 mm 并充滿(mǎn)1 ×105U/L 肝素鈉生理鹽水的聚乙烯導(dǎo)管，經(jīng)右側(cè)頸總動(dòng)脈向心端緩慢插入左心室，導(dǎo)管另一端通過(guò)壓力換能器連接到生理記錄儀，同步采集心率(heart rate，HR)、左心室收縮壓(left ventricular systolic pressuer，LVSP)、左心室舒張末期壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)和左心室內(nèi)壓最大上升或下降速率(±dp/dtmax)。LVEDP≥15 mmHg 為心衰模型成功的標(biāo)志。

5 記錄血壓、心率和腎交感神經(jīng)活動(dòng)

血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)后對(duì)符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的各手術(shù)大鼠行頸部切口并分離氣管，行氣管切開(kāi)，股靜脈置管，術(shù)中使用肌松劑馳肌碘(gallamin)以25 mg·kg-1·h-1持續(xù)泵入。行頸部切口并分離右頸總動(dòng)脈，導(dǎo)管接壓力換能器，與橋式放大器相連，POWERLAB 8/30 同步采集測(cè)動(dòng)脈血壓、平均動(dòng)脈壓和心率(HR);后將動(dòng)物俯位固定于大鼠腦立體定位儀上，再將大鼠取側(cè)俯臥位，經(jīng)腹膜后暴露左腎，在手術(shù)顯微鏡下剝離腎交感神經(jīng)，將神經(jīng)置于雙極鉑絲電極上，灌入配制好的溫?zé)嵋后w石蠟(37 ℃)，使神經(jīng)與記錄電極結(jié)合處于周?chē)M織絕緣并濕潤(rùn)和保護(hù)神經(jīng)。POWERLAB 8/30 系統(tǒng)采集信號(hào)，記錄腎交感神經(jīng)活動(dòng)(renal sympathetic nerve activity，RSNA)。

6 室旁核(paraventricular nucleus，PVN)定位和微量注射

大鼠固定在腦立體定位儀上，沿矢狀縫做皮膚切口暴露顱骨，調(diào)整前囟和后囟至同一水平。PVN 定位:B=1.8 mm，L=0.4 mm，H=7.9 mm。B 表示為前囟向后，L 表示正中線(xiàn)左右旁開(kāi)，H 表示硬腦膜下深度。電鉆顱骨鉆孔，再用微量注射器插入PVN 內(nèi)。

7 定位與組織學(xué)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，10% KCl 靜脈注入處死動(dòng)物，以此時(shí)神經(jīng)放電積分值作為腎交感神經(jīng)放電活動(dòng)的噪聲水平。室旁核內(nèi)微量注射2% 滂胺天藍(lán)溶液(50 nL)。剪取頭顱，去除顱骨，將腦組織固定于10% 甲醛溶液中，2 d 后作切片，在顯微鏡下定位微量注射點(diǎn)位置，定位不準(zhǔn)確者不列入統(tǒng)計(jì)。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 大鼠心功能評(píng)價(jià)

1.1 血流動(dòng)力學(xué)的測(cè)定 術(shù)后4 周檢測(cè)大鼠血流動(dòng)力學(xué)，手術(shù)組大鼠LVEDP 較假手術(shù)組明顯增高(P ＜0.05)，LVSP高于假手術(shù)組，但無(wú)顯著差異，見(jiàn)表1。

表1 手術(shù)組與假手術(shù)組血流動(dòng)力學(xué)比較Table 1. Hemodynamics in rats with heart failure and shamed-operated rats (±s)

表1 手術(shù)組與假手術(shù)組血流動(dòng)力學(xué)比較Table 1. Hemodynamics in rats with heart failure and shamed-operated rats (±s)

* P ＜0.05 vs sham group. HF:heart failure;sham:sham-operated.

Group n LVSP(mmHg) LVEDP(mmHg) +dp/dtmax(mmHg/s) -dp/dtmax(mmHg/s)HF 35 61.6 ±10.5 23.7 ±9.7* 1 286.7 ±97.6* -1 353.8 ±85.7*Sham 30 53.2 ±12.4 4.8 ±4.6 3 284.9 ±648.4 -1 843.9 ±187.8

1.2 心臟、肺組織與體重比的測(cè)量 取實(shí)驗(yàn)后大鼠心臟，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即剪開(kāi)胸壁暴露心臟與肺臟，隨即剪取心臟與肺臟，將心臟在濾紙上瀝干，稱(chēng)重。同時(shí)稱(chēng)取肺濕重。將心臟重與總體重相除，得到心臟/體重值，將肺濕重與總體重相除，得到肺/體重值。假手術(shù)組及心衰組大鼠的指標(biāo)均來(lái)自于手術(shù)后4 周獲得的組織標(biāo)本。心衰組大鼠的心臟/體重指數(shù)高于假手術(shù)組，差異顯著(P ＜0.01)，說(shuō)明心梗后慢性心衰而引起的心臟肥大;心衰組大鼠的肺/體重指數(shù)高于假手術(shù)組(P ＜0.01)，提示有心力衰竭引起的肺水腫，見(jiàn)表2。

表2 心衰大鼠心、肺重與體重比及心梗占左心室面積比的變化Table 2. Changes of heart weight(HW)/body weight(BW)，lung weight(LW)/BW and infarct area(IA)/left ventricular area(IA/LVA)in rats(±s)

表2 心衰大鼠心、肺重與體重比及心梗占左心室面積比的變化Table 2. Changes of heart weight(HW)/body weight(BW)，lung weight(LW)/BW and infarct area(IA)/left ventricular area(IA/LVA)in rats(±s)

＊＊P ＜0.01 vs sham group.

Group n HW/BW(mg/g) LW/BW(mg/g) IA/LVA(%)HF 31 5.4±1.4＊＊ 9.8±2.8＊＊ 49.5±8.5＊＊Sham 30 2.7±0.4 6.9±0.9 0

1.3 心臟病理組織學(xué)觀察 觀察心臟病理組織學(xué)變化，并采用Image-Pro Plus 6.0 軟件面積法測(cè)定該心臟心梗面積占左室面積的比值，該比值≥30%為冠脈結(jié)扎術(shù)誘導(dǎo)心衰模型成功標(biāo)志。見(jiàn)表2。

2 大鼠血壓、心率和腎交感神經(jīng)活性的變化

表3 中可以看出，HF AT1組大鼠與sham AT1組比較，前者腎交感神經(jīng)放電活動(dòng)明顯減弱(P ＜0.05)，HF AT2組與sham AT2組比較，腎交感神經(jīng)放電無(wú)顯著變化，各組大鼠注射藥物前后HR 和MAP 均有改變，但無(wú)明顯差異。

圖1 顯示，腎交感神經(jīng)的放電活動(dòng)在AT1受體阻滯劑L-158809注射后，手術(shù)組和假手術(shù)組大鼠都有減弱趨勢(shì)，手術(shù)組減弱較假手術(shù)組減弱更為明顯，見(jiàn)圖1A、B。腎交感神經(jīng)的放電活動(dòng)在AT2受體阻滯劑PD123319 注射前后手術(shù)組與假手術(shù)組改變不明顯，見(jiàn)圖1C、D。

討 論

本研究使用SD 大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎導(dǎo)致心梗從而誘導(dǎo)慢性心衰動(dòng)物模型，4 周后可見(jiàn)，心衰組心臟/體重比與肺/體重比指數(shù)均高于假手術(shù)組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;心衰組大鼠LVEDP 較假手術(shù)組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;心臟病理組織學(xué)變化顯示梗死面積＞30%(梗死面積為49.5 ±8.5)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明心衰模型制作成功。

表3 各組大鼠PVN 微量注射AT1 和AT2 受體阻滯劑的效應(yīng)Table 3. Averaged changes of RSNA，HR and MAP before and after microinjection into the paraventricular nucleus(PVN)of the hypothalamus (±s)

表3 各組大鼠PVN 微量注射AT1 和AT2 受體阻滯劑的效應(yīng)Table 3. Averaged changes of RSNA，HR and MAP before and after microinjection into the paraventricular nucleus(PVN)of the hypothalamus (±s)

* P ＜0.05 vs sham AT1 group. Veh:injection into PVN with ACSF in HF rats and sham rats.AT1:injection with AT1 receptor antagonist (L -158809)into PVN of HF rats and sham rats.AT2:injection with AT2 receptor antagonist (PD123319)into PVN of HF rats and sham rats.

Group n Heart rate(min -1)Mean arterial pressure(mmHg)Renal sympathetic nerve activity(RSNA)(%)HF Veh 12 12.0±5.3 0.5±3.3 9.2±2.6 Sham Veh 10 6.0±6.2 2.2±1.3 0.5±3.4 HF AT1 10 -4.3±6.8 -4.5±5.4 -50.3±1.4*Sham AT1 10 -2.3±4.5 5.5±2.7 -12.2±2.7 HF AT2 9 4.5±7.2 -0.4±7.1 9.0±2.9 Sham AT2 10 -3.6±9.2 -2.3±1.8 10.3±2.8

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，心力衰竭時(shí)循環(huán)內(nèi)分泌激活，可加速心力衰竭的惡化，慢性心衰大鼠腎交感神經(jīng)活性明顯高于假手術(shù)組［6］，這與我們的研究結(jié)果相一致。從我們的結(jié)果中可見(jiàn)，手術(shù)組RSNA 在注射AT1受體阻滯劑L -158809 后比注射前明顯減弱，而假手術(shù)組減弱不明顯;手術(shù)組注射AT2受體阻滯劑PD123319 前后改變不明顯，而假手術(shù)組亦無(wú)相關(guān)改變。PVN 是自主性和內(nèi)分泌性反應(yīng)的重要整合中樞，在維持心血管活動(dòng)的動(dòng)態(tài)平衡中起著關(guān)鍵作用。心衰時(shí)PVN 中AT1受體介導(dǎo)的血管緊張素反應(yīng)對(duì)交感神經(jīng)功能的調(diào)節(jié)有重要的作用［7］。心衰大鼠PVN 內(nèi)AT1受體上調(diào)，使用Ang II 可明顯引起腎交感放電的增強(qiáng)［7，8］。本研究中，AT1受體阻滯劑影響了Ang Ⅱ受體介導(dǎo)的交感信號(hào)的輸出，阻斷了相關(guān)興奮性信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制了腎交感神經(jīng)的放電。最近，Gao等［9］發(fā)現(xiàn)，心衰大鼠中RVLM 內(nèi)AT1受體蛋白的表達(dá)明顯升高，而AT2受體蛋白表達(dá)明顯下降，AT1/AT2受體比例上升。本研究使用AT2受體阻滯劑后手術(shù)組及假手術(shù)組的RSNA神經(jīng)放電改變不明顯，以此推測(cè)，心衰大鼠PVN 內(nèi)AT2受體表達(dá)不升高，不排除AT2受體無(wú)AT1相關(guān)介導(dǎo)作用。若要明確相關(guān)機(jī)制還需進(jìn)一步研究探討。

本研究就心衰SD 大鼠下丘腦室旁核對(duì)AT1和AT2受體阻滯劑微量注射后腎交感神經(jīng)的反應(yīng)進(jìn)行了相關(guān)研究，中樞受體AT1對(duì)心衰的慢性激活有重要意義，而AT2意義不大，為慢性心衰的病理生理研究和治療提供了依據(jù)。

Figure 1. Changes of ABP，MAP，HR and RSNA before and after injection with AT1 receptor antagonist(L-158809)and AT2 receptor antagonist(PD123319)into PVN.ABP:ambulatory blood pressure;MAP:mean arterial pressure;HR:heart rate;RSNA:renal sympathetic nerve activity.A:injection with L-158809 into PVN in heart failure(HF)rats;B:injection of L-158809 into PVN in sham-operated (sham)rats;C:injection with PD123319 into PVN in HF rats;D:injection PD123319 into PVN in sham rats.圖1 大鼠血壓、心率及腎交感神經(jīng)活動(dòng)的變化

［1］ Neubauer S. The failing heart-an engine out of fuel［J］.N Engl J Med，2007，356 (11):1140 -1151.

［2］ Atlas SA. The renin - angiotensin aldosterone system:pathophysiological role and pharmacologic inhibition［J］. J Manag Care Pharm，2007，13(8 Suppl B):9 -20.

［3］ Francis J，Wei SG，Weiss RM，et al. Brain angiotensin -converting enzyme activity and autonomic regulation in heart failure［J］. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004，287(5):H2138 -H2146.

［4］ Ferguson AV，Latchford KJ，Samson WK.The paraventricular nucleus of the hypothalamus - a potential target for integrative treatment of autonomic dysfunction［J］. Expert Opin Ther Targets，2008，12(6):717 -727.

［5］ 楊世方，凌亦凌，戴鴻雁，等.八肽膽囊收縮素對(duì)正常及腦缺血大鼠大腦皮層NO 水平的調(diào)節(jié)［J］.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2003，20(2):103 -106.

［6］ Wang RJ，Zeng QH，Wang WZ，et al. GABAAand GABABreceptor-mediated inhibition of sympathetic outflow in the paraventricular nucleus is blunted in chronic heart failure［J］. Clin Exp Pharmacol Physiol，2009，36(5 -6):516 - 522.

［7］ Zhu GQ，Gao L，Li Y，et al.AT1receptor mRNA antisense normalizes enhanced cardiac sympathetic afferent reflex in rats with chronic heart failure［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，287(4):H1828 -H1835.

［8］ Zheng H，Li YF，Wang W，et al. Enhanced angiotensin -mediated excitation of renal sympathetic nerve activity within the paraventricular nucleus of anesthetized rats with heart failure［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2009，297(5):R1364 -R1374.

［9］ Gao L，Wang WZ，Wang W，et al.Imbalance of angiotensin type 1 receptor and angiotensin II type 2 receptor in the rostral ventrolateral medulla［J］. Hypertension，2008，52(4):708 -714.