張德太， 張 科， 楊 文， 胡麗華

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗科，湖北 武漢430022)

低氧誘導因子1(hypoxia－inducible factor－1，HIF－1)在哺乳動物細胞缺氧誘導的基因表達調節(jié)中起著關鍵作用。HIF－1 由α 和β 兩個亞基組成，HIF－1α 是調節(jié)細胞缺氧反應的主要轉錄因子，在許多腫瘤中高表達，與腫瘤高侵襲性、易轉移、對放化療不敏感和預后不良密切相關［1］。

HIF－1α 在常氧條件下能通過脯氨酰羥化作用而迅速降解，半衰期不到5 min［2］。低氧狀態(tài)時，HIF－1α 降解途徑被阻斷。研究表明，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide－adenine dinucleotide phospate，NADPH)依賴的細胞色素P－450 還原酶(NADPH cytochrome P－450 reductase，NPR)不僅介導了缺氧環(huán)境下HIF－1α 的信號轉導，并且在維持其穩(wěn)定性方面發(fā)揮作用;NADPH 作為NPR 的底物，可能在此過程中扮演重要角色［3］。葡萄糖－6－磷酸脫氫酶(glucose－6－phosphate dehydrogenase，G6PD)是磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway，PPP)的關鍵酶，主要作用是提供體內NADPH，在許多腫瘤細胞中亦發(fā)現(xiàn)G6PD 高表達并且與某些生物學特性密切相關［4－6］。那么，是否能通過阻抑腫瘤細胞G6PD 的同時下調HIF－1α，達到協(xié)調干預瘤細胞的缺氧反應呢?目前尚缺乏實驗依據(jù)，本文將對此展開研究。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 細胞、質粒和菌株 人結腸癌細胞株(LoVo)購自中國科學院。含有綠色熒光蛋白、耐卡那霉素基因、抗新霉素基因及人U6 啟動子的質粒pEGFPC1－U6 和大腸桿菌DH5α 均購自武漢晶賽公司。

1.2 主要試劑與工具酶 胎牛血清(FBS)購自Gibco;兔抗人HIF－1α 抗體購自R＆D;兔抗人β－actin抗體和蛋白質印跡化學發(fā)光檢測試劑盒購自Santa Cruz;辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgGⅡ抗購于武漢博士德公司;PVDF 膜購自PALL;DL－2000 marker 和瓊脂糖膠回收試劑盒為TaKaRa 產品，脂質體轉染試劑盒Lipofectamine 2000 購自Invitrogen;反轉錄試劑與T4 連接酶、Taq 酶及各種限制性內切酶均購自Promega ;質粒提取試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司;葡萄糖－6－磷酸二鈉鹽(G6P·Na2)、氧化型輔酶II(NADP)均為Sigma 產品;NADPH 定量試劑盒購自上海越研生物科技公司。

1.3 儀器 引物設計軟件為Primer 5.0，電泳儀為北京六一產品，可見－紫外分光光度計為Shimadzu產品，超聲粉碎勻漿器由寧波新芝科器研究所生產。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)及低氧處理 人結腸癌細胞株(Lo-Vo)用含有10%胎牛血清、適當非必需氨基酸和丙酮酸的DMEM 培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每2－3 d 傳代1 次，傳代時用0.25%胰蛋白酶(含0.1%EDTA)進行消化。細胞生長至次融合狀態(tài)時進行低氧處理:以去氣泡培養(yǎng)液換液，置細胞于充入5% CO2及90%氮氣(氧氣濃度為5%)的37℃孵箱中培養(yǎng)36 h。

2.2 siRNA 序列的設計 從GenBank 中查找人G6PD mRNA 序列(NM－000402)，參照文獻［7，8］設計出2 條特異性的siRNA 寡核苷酸序列(分別為siRNA1 和siRNA2)，利用RNA Structure 軟件分析其mRNA 二級結構，并進行BLAST 同源性分析。其中，siRNA1:正 義 鏈 5'－GATCCCGCCTCAGTGCCACTTGACATTGATATCCGTGTCAAGTGGCACTGAGGCTTT-TTTCCAAC－3'，反義鏈5'－TCGAGTTGGAAAAAAGCCTCAGTGCCACTTGACACGGATATCAA-TGT CAAGTGGCACTGAGGCGG－3';siRNA2:正義鏈 5'－GATCCCCGTGAGAGAATCTGCCTGTTTGATATCCGACAGGCAGATTCTCTCACGTTTTTTCCAAC－3'， 反 義 鏈 5'－TCGAGTTGGAAAAAACGTGAGAGAATCTGCCTGTCGGATATCAAACAGGCAGATTCTCTCACGGG－3'。同時選取1 對與人G6PD 基因序列完全沒有同源性的siRNA 寡核苷酸序列作為陰性對照，均送上海生物工程有限公司合成。

2.3 載體質粒的構建與鑒定 將pEGFP－C1－U6質粒和合成的siRNA 用足量的BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切消化，低融點瓊脂糖凝膠電泳后回收大片段;將上述回收片斷在T4 連接酶作用下，22 ℃連接反應過夜;各取2 μL 連接產物轉化感受態(tài)DH5α，涂布于含卡那霉素抗性的LB 平皿上，37 ℃恒溫過夜，從平皿中各挑選3 個單克隆菌落于3 mL 含卡那霉素抗性的LB 培養(yǎng)液中，37 ℃、270 r/min 搖床培養(yǎng)過夜;用質粒純化試劑盒提取質粒，并做PstⅠ酶切鑒定，挑選鑒定正確的克隆進行DNA 測序分析。

2.4 細胞轉染 應用LipofectamineTM2000 脂質體載體介導方法將pEGFP－C1－U6/ G6PD 質粒轉染至LoVo 細胞。將細胞用胰酶消化，計數(shù)，取兩個6孔板鋪板:1－3 孔為轉染pEGFP－C1－U6/ G6PD質粒的LoVo 細胞(轉染組)，4－6 孔為轉染pEGFP－C1－U6/ UC 質粒的LoVo 細胞(質粒對照組)，7－9 孔為未做任何轉染處理的LoVo 細胞(未轉染組)。轉染48 h 后，采用G418 進行逐步篩選，篩選8 周后獲得穩(wěn)定克隆。

2.5 RT－PCR 檢測干擾效率 將穩(wěn)轉細胞在缺氧環(huán)境中連續(xù)培養(yǎng)36 h，收集細胞并以冷PBS 清洗后采用Trizol 試劑提取各組細胞總RNA，用Oligo(dT)18及M－MLV 將其逆轉錄成cDNA。取逆轉錄產物進行PCR 擴增，G6PD 的擴增引物為正義鏈5'－AGCAGACGAGAAGCCCAAGC－3'，反義鏈5'－AGGATGACGCAGGCGATG－3'，擴增條件為94 ℃45 s，63 ℃40 s，72 ℃40 s，擴增產物為432 bp。

2.6 細胞內G6PD 活性及NADPH 測定 將細胞用PBS 清洗后在冷裂解緩沖液(50 mmol/L Tris－HCl，150 mmol/L NaCl，1% Triton X－100，100 mg/L PMSF，5 mg/L leupeptin，5 mg/L aprotin)中0 ℃裂解30 min，10 000 r/ min 離心15 min。取上清采用Bradford 法進行蛋白定量，參照文獻［8］，用紫外分光光度法測定340 nm 時一定量總蛋白中G6PD 在單位時間內將NADP+轉變?yōu)镹ADPH 的量來確定G6PD酶活性，單位以U/g 蛋白表示。參照試劑盒說明進行NADPH 定量測定。

2.7 檢測HIF－1α mRNA 表達 將轉染組、質粒對照組、未轉染組的LoVo 細胞分別進行缺氧培養(yǎng)36h，收集細胞按前述處理方法提取RNA，逆轉錄成cDNA，取逆轉錄產物進行PCR 擴增，HIF－1α 擴增的上游引物為5'－GCAAGACTTTCCTCAGTCGACACA－3'，下游引物5'－GCATCCTGTACTGTCCTGTGGTGA－3'，擴增片段長度207 bp，同時設β－actin為內參照，擴增的上游引物為5’－ TCCATCATGAAGTGTGACGT－ 3’，下游引物為5’－TACTCCTG CTTGCTGATCCAC－ 3’擴增片段長度245 bp。擴增體系為:10 × buffer 2.0 μL，dNTPs (10 mmol/L)0.5 μL，上游引物(10 μmol/L)0.5 μL，下游引物(10 μmol/L)0.5 μL，Taq 酶1U，BSA (1 g/L )1.0 μL，cDNA 模板1.0 μL，MgCl2(25 mmol/L)3.5 μL，用雙蒸水補足至20 μL。HIF－1α 的擴增條件:94 ℃45 s，58 ℃40 s，72 ℃40 s;β－actin 的擴增條件為94 ℃45 s，63 ℃40 s，72 ℃40 s。擴增30個循環(huán)后將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳及EB 染色，暗室中用紫外透射儀檢查并攝影。

2.8 檢測HIF－1α 蛋白表達 分別將轉染組、質粒對照組、未轉染組的LoVo 細胞進行缺氧培養(yǎng)36 h，收集細胞離心去上清，以冷PBS 洗滌2 次。細胞沉淀用0.5 mL 細胞裂解緩沖液［組成:1 mol/ L Tris－HCl (pH 8.0)，0.15 mol/ L NaCl ，1.0 % Triton X－100，100 mg/L PMSF］重懸，置冰上搖床30 min后，于4 ℃、12 000 r/ min 離心5 min，取上清進行蛋白定量。取25 μg 蛋白樣品經10 %SDS－PAGE，120 V 80 min 電泳分離總蛋白，以半干式電轉儀100 V 80 min轉移蛋白至PVDF 膜。膜用含5 %脫脂奶的PBST 室溫孵育1 h 后加入兔抗人多克隆HIF－1α 抗體(稀釋度1∶250)，β－actin Ⅰ抗(稀釋度1∶400)，4 ℃雜交過夜。次日洗膜3 次，每次15 min，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG Ⅱ抗(稀釋度1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBS 漂洗，應用ECL 試劑盒行發(fā)光反應，圖像掃描分析。

3 統(tǒng)計學處理

結 果

1 siRNA 重組子的鑒定

pEGFP－C1－U6 質粒有PstⅠ的酶切位點，能夠被PstⅠ所酶切，而經BamH I 和Xho Ⅰ酶切后，中間插入目的序列后PstⅠ酶切位點被取代，故重組質粒不能被PstⅠ所切開。再用SalⅠ和Xho Ⅰ雙酶切，經電泳分析，構建成功的質粒均被切出1 條400 bp大小的DNA 帶，見圖1。經酶切后，挑取鑒定正確的克隆進行測序分析，結果顯示，重組質粒siRNA 序列與設計的片段完全一致，說明重組質粒構建成功。

Figure 1. Identification of recombinant plasmids by restriction endonuclease SalⅠand XhoⅠ. M:DL2000 marker;1，2，3:recombinant plasmids were digested with SalⅠand XhoⅠ.圖1 重組質粒SalⅠ+ XhoⅠ雙酶切后電泳結果

2 重組質粒篩選

取質粒轉染組(siRNA1 和siRNA2)、質粒對照組和未轉染組的LoVo 細胞在缺氧條件下培養(yǎng)36 h后提取RNA，RT－PCR 檢測G6PD mRNA 表達水平。以未轉染組細胞的G6PD mRNA 的表達豐度為1.0，其它細胞與其對比分析。轉染siRNA1 的LoVo細胞G6PD mRNA 的相對表達豐度為0.57，轉染siRNA2 的相對表達豐度為0.76，見圖2，故選用轉染siRNA1 的細胞進行后續(xù)實驗。

Figure 2. Effect of RNA interference on G6PD mRNA expression. 1，non－transfection:no plasmid transfection;2，control:empty plasmid transfection;3，siRNA1:siRNA1 plasmid transfection;4，siRNA2:siRNA2 plasmid transfection. ±s. n=3. * P ＜0.05 vs nontransfection.圖2 轉染siRNA 對G6PD mRNA 表達的干擾效率

3 siRNA 對G6PD 活性的影響

選擇質粒轉染組(siRNA1)、質粒對照組、未轉染組的LoVo 細胞在缺氧條件下培養(yǎng)36 h 后測定細胞內G6PD 活性。siRNA 沉默G6PD 基因后其活性與未轉染組和質粒對照組比較有顯著下降(P ＜0.05)，轉染質粒對照組的細胞G6PD 活性與未轉染組無明顯變化，見圖3。

Figure 3. Effect of RNA interference on G6PD activity. Non－transfection:no plasmid transfection;control:empty plasmid transfection;siRNA1:siRNA1 plasimid transfection.±s. n=3. * P ＜0.05 vs non－transfection.圖3 siRNA 對G6PD 活性的影響

4 siRNA 沉默G6PD 基因對胞內NADPH 水平的影響

質粒轉染組(siRNA1)、質粒對照組和未轉染組的LoVo 細胞在缺氧條件下培養(yǎng)36 h 后測定細胞內NADPH 水平，以未轉染組細胞NADPH 水平為參照。siRNA 沉默G6PD 基因的LoVo 細胞缺氧處理36 h后胞內NADPH 水平較未轉染組細胞有顯著下降(P＜0.05)，而轉染質粒對照組與未轉染組無明顯變化，見圖4。

Figure 4. Effect of RNA interference on NADPH concentration in LoVo cells. Non－transfection:no plasmid transfection;control:empty plasmid transfection;siRNA1:siRNA1 plasmid transfection. ±s. n =3. * P ＜0.05 vs non－transfection.圖4 siRNA 沉默G6PD 基因對胞內NADPH 水平的影響

5 G6PD 沉默對LoVo 細胞內HIF－1α mRNA 的影響

siRNA 沉默G6PD 基因的LoVo 細胞在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)36 h 后經RT－PCR 檢測，HIF－1α mRNA 表達水平無明顯改變，見圖5。

Figure 5. Effect of RNA interference on HIF－1α mRNA expression in LoVo cells by RT－PCR. 1，siRNA1:siRNA1 plasmid transfection;2，control:empty plasmid transfection;3，non－transfection:no siRNA plasmid transfection. ±s. n=3.圖5 G6PD 沉默對LoVo 細胞內HIF－1α mRNA 的影響

6 G6PD 沉默對HIF－ 1α 蛋白水平的影響

siRNA 沉默G6PD 基因的LoVo 細胞在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)36 h 后經Western blotting 檢測，HIF－1α 蛋白表達水平較未轉染組細胞有顯著下降，見圖6。

Figure 6. Effect of RNA interference on HIF－1α protein expression. 1，siRNA1:siRNA1 plasmid transfection;2，control:empty plasmid transfection;3，non－transfection:no plasmid transfection. ±s. n =3. * P ＜0.05 vs non－transfection.圖6 G6PD 沉默對HIF－ 1α 蛋白水平的影響

討 論

HIF－1 在缺氧誘導的基因表達調節(jié)中起著關鍵作用，HIF－1α 是其唯一的氧調節(jié)亞基，它決定HIF－1 的活性［9］。當氧分壓降低或其它因素起調節(jié)作用時，HIF－1α 降解途徑被阻斷，HIF－1α 在核內聚集，并與β 亞基形成有活性的異二聚體HIF－1 ，再與下游靶基因上的缺氧反應元件(HRE)結合，調控下游百余種靶基因轉錄，在調節(jié)葡萄糖代謝、促進細胞增殖與存活、抑制凋亡、促進血管發(fā)生等方面具有重要的作用［10］。HIF－1α 不僅在腫瘤的局部和轉移灶中高表達，而且與腫瘤的分化特性、演進過程、侵襲、轉移能力及預后狀況直接有關，針對腫瘤多種信號轉導通路的抑瘤劑大多間接抑制了HIF－1 的作用［11，12］。因此，HIF－1α 已成為腫瘤治療中的一個重要靶點。

也有研究表明，調控G6PD 能顯著改變瘤細胞的生物學特性，因此G6PD 是腫瘤防治中的一個有價值的候選基因［13，14］?？紤]到通過NADPH 可以將G6PD 與HIF－1α 直接聯(lián)系起來，故本研究選擇通過siRNA 技術沉默G6PD 基因觀察其對另一個重要的腫瘤治療靶點HIF－1α 的影響。

本文結果顯示，靶向G6PD 基因的siRNA 能有效沉默G6PD，其mRNA 表達水平下降43%，酶活性下降63.5%。G6PD 基因沉默也直接影響到NADPH的生產效率，瘤細胞內NADPH 水平較未轉染組細胞有十分顯著的下降(41% vs 100%，P ＜0.05)。

另一方面，本研究也觀察到G6PD 基因沉默后的LoVo 細胞經過缺氧處理后HIF－1α mRNA 表達水平未發(fā)生明顯變化，但HIF－1α 蛋白水平有顯著下降。因此，G6PD 影響HIF－1α 水平可能不是通過基因表達方式而更可能是通過改變HIF－1α 的穩(wěn)定性完成的，結合G6PD 對胞內NADPH 水平的調節(jié)作用，我們認為NADPH 水平可能是導致HIF－1α 穩(wěn)定性下降的一個重要原因。當然也不排除G6PD 基因沉默影響到HIF－1α 蛋白的表達效率，這將是下一步需要研究的問題。

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