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        cAMP信號(hào)分子在缺血后適應(yīng)心肌保護(hù)機(jī)制中的作用

        2011-11-13 07:57:06鄧?guó)P君林煥冰徐江平
        中國(guó)病理生理雜志 2011年8期
        關(guān)鍵詞:離體普蘭灌流

        王 茜, 鄧?guó)P君, 林煥冰, 徐江平△

        (1南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院神經(jīng)藥理課題組,廣東廣州510515;2益陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校藥理教研室,湖南益陽(yáng)413000)

        再灌注治療是急性心肌梗死的重要治療手段。然而再灌注治療在迅速恢復(fù)缺血心肌的血流、挽救大量瀕死心肌的同時(shí)也導(dǎo)致心肌明顯損傷,即“缺血再灌注損傷 (ischemia reperfusion injury,I/R)”。缺血再灌注損傷的發(fā)生降低了臨床治療效果。建立減少缺血再灌注損傷的治療方案是最近30年急性心肌梗死治療的重要研究方向。有研究發(fā)現(xiàn),在心臟缺血發(fā)生之前進(jìn)行缺血預(yù)適應(yīng)干預(yù)可以發(fā)揮心臟保護(hù)作用,但由于缺血事件不可預(yù)知性,該措施則難以應(yīng)用。近年大量實(shí)驗(yàn)研究與臨床應(yīng)用表明,在心肌缺血后、恢復(fù)長(zhǎng)期血流之前,進(jìn)行一次或數(shù)次短暫重復(fù)的缺血/再灌注處理,即缺血后適應(yīng)(ischemic postconditioning)能提高缺血心肌對(duì)之前發(fā)生的較長(zhǎng)時(shí)間缺血的耐受性。與預(yù)適應(yīng)相比,它具有更好的可預(yù)測(cè)性和臨床可控性[1]。但缺血后適應(yīng)也可能會(huì)導(dǎo)致潛在的并發(fā)癥。因而有學(xué)者提出“藥物后適應(yīng)”,即通過(guò)使用模擬內(nèi)源性機(jī)制的藥物來(lái)發(fā)揮后適應(yīng)的保護(hù)作用。而應(yīng)用藥物后適應(yīng)則需要對(duì)后適應(yīng)的機(jī)制進(jìn)行研究。

        第二信使環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)參與對(duì)心臟廣泛的細(xì)胞功能和形態(tài)學(xué)過(guò)程,包括心肌變力狀態(tài)、變時(shí)性、凋亡和肥大的調(diào)節(jié)過(guò)程。且有研究發(fā)現(xiàn)活化腺苷酸環(huán)化酶(adenyl cyclase,AC)/cAMP通路的藥物能引出缺血心肌的延遲保護(hù)作用[2]。但cAMP在后適應(yīng)中的作用還不是很清楚。因此我們采用離體心臟灌流模型,觀察后適應(yīng)對(duì)心臟組織的保護(hù)作用,以及AC抑制劑SQ22536和磷酸二酯酶4(phosphodiesterase 4,PDE4)抑制劑洛利普蘭(rolipram)對(duì)后適應(yīng)的影響,探討cAMP在后適應(yīng)保護(hù)心臟中的作用。

        材料和方法

        1 材料

        Sprague-Dawley(SD)大鼠(210-260 g)由廣州南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào)為粵檢證字第2006-0015號(hào);PCLab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)(北京微信斯達(dá)科技發(fā)展有限公司);肌酸激酶(creatine kinase,CK)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)測(cè)試盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所,洛利普蘭和SQ22536購(gòu)自Sigma-Aldrich。

        2 方法

        2.1 實(shí)驗(yàn)分組與模型建立 51只大鼠隨機(jī)分為6組。2.5%戊巴比妥鈉 (50 mg/kg)腹腔注射麻醉,舌下靜脈注射肝素1 000 IU/kg抗凝。開(kāi)胸迅速取心臟,置于4℃改良K-H液中,排盡殘血后經(jīng)主動(dòng)脈將心臟懸掛于Langendorff灌流裝置上,用37℃經(jīng)混合氣(95%O2和5%CO2)平衡的K-H緩沖液行主動(dòng)脈逆行灌流(灌注壓為80 cmH2O)。K-H液成分(mmol/L):NaCl 118,KCl 4.7,CaCl21.25,MgSO41.2,NaHCO325,KH2PO41.2,glucose,11.1。實(shí)驗(yàn)分組:(1)正常組(control,n=8):K-H液持續(xù)灌流120 min;(2)缺血再灌注組(I/R group,n=11):以K-H液平衡15-20 min,37℃停灌45 min,再灌注60 min;(3)后適應(yīng)組(post,n=10):再灌前給予6個(gè)循環(huán)的30 s I/30 s R;(4)缺血再灌注后適應(yīng)+洛利普蘭組(post+roli 10μmol/L,n=8):以KH液平衡15 -20 min,改用含10μmol/L洛利普蘭的K-H液灌流10 min,停灌45 min,行后適應(yīng)處理并再灌注60 min;(5)缺血再灌注后適應(yīng)+SQ22536組(post+SQ22536,n=7):以 K-H液平衡15-20 min,改用含500 mmol/L SQ22536的K-H液灌流10 min,停灌45 min,行后適應(yīng)處理并再灌注60 min;(6)缺血再灌注+洛利普蘭組(I/R+roli,n=7):不行后適應(yīng)處理,余下過(guò)程同缺血再灌注后適應(yīng)+洛利普蘭組。

        2.2 左室功能檢測(cè) 心臟復(fù)跳后,將一連接壓力換能器的球囊插入左心室,壓力換能器與PClab多導(dǎo)生理記錄儀相連,在電腦上連續(xù)記錄左室內(nèi)壓變化,并計(jì)算左室發(fā)展壓(left ventricular developed pressure,LVDP)=最大心室內(nèi)壓-最小心室內(nèi)壓。同時(shí)記錄冠脈流量(coronary flow,CF)。

        2.3 組織病理學(xué)檢查 再灌60 min后取少許心臟組織4%甲醛固定,石蠟包埋切片,HE染色,光鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢查。

        2.4 冠脈流出液酶學(xué)檢測(cè) 分別于停灌前、再灌流60 min時(shí)收集冠脈流出液以測(cè)定其中LDH和CK含量(按試劑盒說(shuō)明操作)。

        2.5 Total RNA抽提及 real-time PCR 再灌流60 min后取心肌組織,用Trizol試劑提取總RNA,取3μg逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。應(yīng)用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。各基因引物序列如下:β-actin正義鏈 5'-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC -3',反義鏈5'-CCATACCCAGGAAGGAAGGCT-3';caspase-3正義鏈 5'-GGAGCAGAGCCATGGGCACG -3',反義鏈5'-GCACAGACGCCCTGATGGGG -3';bax正義鏈5'-GGCCCACCAGCTCTGAACAG -3',反義鏈5'- GCAATCATCCTCTGCAGCTCCATATTA -3';bcl-2正義鏈5'- TGGAGAGCGTCAACAGGGAGATGTAC -3',反義鏈 5'- TGGAGAGCGTCAACAGGGAGATGTAC-3'。用Oligo dT18引物逆轉(zhuǎn)錄獲得總cDNA,實(shí)施實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。以ΔCt表示目的基因與β-actin Ct值的差值、ΔΔCt表示對(duì)照組與處理各組 ΔCt的差值,2-ΔΔCt反映目的基因mRNA的相對(duì)含量。

        3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,采用SPSS13.0軟件處理,組間顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)。

        結(jié) 果

        1 I/R對(duì)離體心臟的影響

        將離體心臟37℃停灌30、40和45 min,以模擬在體心臟缺血缺氧。結(jié)果顯示隨著停灌時(shí)間的延長(zhǎng),LVDP恢復(fù)率隨之下降,分別由79.61%減至61.45%,54.15%和37.71%。停灌45 min時(shí),CF也顯著減少(P<0.05),見(jiàn)圖2。冠脈流出液中LDH和CK分別由352.12 U/L和1.90 kU/L增至615.71 kU/L和2.61 kU/L(P<0.05)。并且心肌組織內(nèi)凋亡調(diào)節(jié)基因caspase-3表達(dá)以及bax/bcl-2比值顯著增高,見(jiàn)圖5、6。組織病理學(xué)檢查顯示:I/R處理組心肌細(xì)胞排列雜亂,橫紋模糊不清或消失,細(xì)胞腫脹并出現(xiàn)明顯空泡樣變性、嗜酸性變及凝固性壞死,見(jiàn)圖7B。說(shuō)明該離體心臟灌流模型可以模擬心肌I/R、具有可行性。

        2 后適應(yīng)對(duì)離體I/R心臟功能的保護(hù)作用

        再灌流60 min后將LVDP和CF進(jìn)行比較,后適應(yīng)處理能顯著增加LVDP(圖1)和CF(圖2)。停灌前各組冠脈流出液中CK及LDH活性差異無(wú)顯著。后適應(yīng)處理能顯著降低冠脈流出液中CK及LDH活性(圖3和4)。檢測(cè)再灌流60 min后心肌組織內(nèi)凋亡相關(guān)基因,也得到相似結(jié)果,即后適應(yīng)處理能顯著降低心肌組織內(nèi)caspase-3 mRNA表達(dá)(圖5)和bax/bcl-2(圖6)比值。組織病理學(xué)檢查可見(jiàn)后適應(yīng)組部分空泡樣變性及嗜酸性變,但細(xì)胞損害程度明顯低于I/R組(圖7)。

        Figure 1.Effects of different treatment on LVDP recovery rate.I/R:ischemia/reperfusion;post:postconditioning;roli:rolipram;SQ:SQ22536.ˉx±s.n=7-11.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs I/R group;△P<0.05 vs post group.圖1 不同處理對(duì)LVDP恢復(fù)率的影響

        Figure 2.Effects of different treatment on coronary flow(CF).Values were expressed as the percentages of CF measured during equilibrium.ˉx±s.n=7-11.*P<0.05 vs control group;#P <0.05 vs I/R group;△P <0.05 vs post group.圖2 不同處理對(duì)CF的影響

        Figure 3.Effects of different treatment on LDH release into coronary artery flow.ˉx±s.n=7-11.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs I/R group;△P <0.05 vs post group.圖3 不同處理對(duì)心肌缺血再灌時(shí)冠脈流出液LDH釋放的影響

        Figure 4.Effects of different treatment on CK release into coronary artery flow.ˉx±s.n=7-11.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs I/R group;△P <0.05 vs post group.圖4 不同處理對(duì)心肌缺血再灌時(shí)冠脈流出液CK釋放的影響

        Figure 5.Effects of different treatment on caspase-3 mRNA expression in myocardium.ˉx±s.n=6.*P<0.05 vs control group;#P <0.05 vs I/R group;△P <0.05 vs post group.圖5 不同處理對(duì)心肌缺血再灌時(shí)心肌組織caspase-3 mRNA表達(dá)的影響

        Figure 6.Effects of different treatment on bcl-2/bax ratio in myocardium.ˉx±s.n=6.*P<0.05 vs control group;#P <0.05 vs I/R group;△P <0.05 vs post group.圖6 不同處理對(duì)心肌缺血再灌時(shí)心肌組織bcl-2/bax的影響

        3 cAMP參與后適應(yīng)對(duì)離體I/R心臟的保護(hù)作用

        10μmol/L PDE4抑制劑洛利普蘭能顯著增強(qiáng)后適應(yīng)對(duì)心臟的保護(hù)作用,表現(xiàn)為:與后適應(yīng)組相比,LVDP顯著增高(圖1)及CF顯著增加(圖2),冠脈流出液中LDH和CK活性均更為降低,見(jiàn)圖3、4。心肌組織內(nèi)凋亡相關(guān)基因檢測(cè)結(jié)果也顯示洛利普蘭能進(jìn)一步增強(qiáng)后適應(yīng)的作用,即caspase-3 mRNA表達(dá)減少(圖5)、bax/bcl-2(圖6)比值降低。而 AC抑制劑SQ22536則能減弱/取消后適應(yīng)對(duì)心臟的保護(hù)作用,LVDP顯著降低(圖1)及CF顯著減少(圖2),冠脈流出液中LDH和CK活性均增高(圖3、4)、心肌組織內(nèi)caspase-3 mRNA表達(dá)增加(圖5)、bax/bcl-2(圖6)比值上升。并且單用洛利普蘭則不能表現(xiàn)出心臟的保護(hù)作用,LVDP、CF、酶學(xué)指標(biāo)和凋亡相關(guān)基因結(jié)果均顯示與I/R組無(wú)顯著差別。組織病理學(xué)檢查可見(jiàn)后適應(yīng)與洛利普蘭共同處理能減輕心肌組織變性及其它病理改變程度,而后適應(yīng)與SQ22536共同處理則組織損害程度重于后適應(yīng)組,見(jiàn)圖7。

        討 論

        缺血再灌注被認(rèn)為是多因素參與、非抗原依賴(lài)性的炎癥反應(yīng)過(guò)程。臨床上,心肌I/R常常引起心律失常、心肌頓抑、心肌冬眠、無(wú)復(fù)流、心肌細(xì)胞損傷、LDH及CK釋放增加和心功能障礙等病理生理變化[3]。本研究顯示,對(duì) Langendorff心臟灌流[4]進(jìn)行停灌/復(fù)流處理,使其出現(xiàn)了LVDP降低和CF減少、心肌LDH和CK釋放增加、凋亡/抗凋亡基因表達(dá)異常、組織病理學(xué)變化,并且凋亡基因mRNA表達(dá)增高、抗凋亡基因表達(dá)降低。這些結(jié)果均與前人一致,說(shuō)明該離體心臟灌流模型可以用來(lái)模擬心肌I/R。

        Figure 7.The pathological examination of myocardium in different groups(HE staining,×l00).A:control;B:I/R;C:post;D:post+roli;E:post+SQ;F:I/R+roli.圖7 各處理組心臟組織學(xué)改變

        缺血后適應(yīng)是一種在心肌再灌注時(shí)進(jìn)行干預(yù)的保護(hù)措施,2003年Zhao等[5]首次報(bào)道了這種干預(yù)可導(dǎo)致心臟梗塞面積減少。隨后大量研究在其它種屬的動(dòng)物如大鼠[6]、小鼠[7]及家兔[8]也證明了缺血后適應(yīng)具有保護(hù)心臟的能力,甚至在臨床實(shí)施經(jīng)皮冠脈介入治療的病人實(shí)行數(shù)次短暫的球囊擴(kuò)張也能夠減輕缺血損傷并改善心肌的灌注。目前對(duì)于缺血后適應(yīng)介導(dǎo)心臟保護(hù)的機(jī)制尚未完全弄清。本研究采用了特異性PDE4抑制劑洛利普蘭和AC抑制劑SQ22536兩個(gè)工具藥來(lái)觀察cAMP在后適應(yīng)介導(dǎo)心臟保護(hù)機(jī)制中的作用。結(jié)果顯示洛利普蘭能進(jìn)一步地增強(qiáng)后適應(yīng)的保護(hù)作用,而SQ22536則抑制了該保護(hù)作用。另一方面,洛利普蘭在沒(méi)有進(jìn)行后適應(yīng)干預(yù)時(shí)并未表現(xiàn)出其保護(hù)I/R心臟的作用,也說(shuō)明了并不是由于cAMP自身濃度增高發(fā)揮作用的,該結(jié)果與前人研究理論一致,即PDE4抑制劑只有在心肌受刺激的狀態(tài)下影響心肌興奮性,而單獨(dú)應(yīng)用其并不能保護(hù)缺血心肌[9]。而后適應(yīng)這種保護(hù)性刺激在cAMP濃度改變時(shí)作用增強(qiáng)或減弱,說(shuō)明cAMP確實(shí)參與了后適應(yīng)對(duì)I/R心臟的保護(hù)機(jī)制。

        關(guān)于I/R引起的心肌細(xì)胞凋亡最初見(jiàn)于1994年Gottlieb等[10]的報(bào)道,隨后越來(lái)越多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床病理標(biāo)本均證實(shí)I/R導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生。也有不同研究發(fā)現(xiàn)缺血預(yù)適應(yīng)、缺血后適應(yīng)均表現(xiàn)出一定的抗心肌細(xì)胞凋亡效應(yīng)[11,12]。細(xì)胞凋亡過(guò)程的分子調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜,其中bcl-2基因具有抗凋亡作用,而bax基因則可對(duì)抗Bcl-2蛋白抗凋亡的作用,細(xì)胞中bax和bcl-2 mRNA比值決定了細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。Caspase-3位于Bcl-2和Bax的下游,是凋亡事件的最終效應(yīng)酶,有研究表明它在心肌I/R損傷中發(fā)揮著非常重要的作用。因此本研究中主要對(duì)caspase-3 mRNA表達(dá)情況和bax/bcl-2比值進(jìn)行觀察,并且再次證實(shí)了缺血后適應(yīng)具有抗心肌細(xì)胞凋亡并改善心功能的作用。而且采用洛利普蘭能增強(qiáng)后適應(yīng)的抗凋亡作用,而SQ22536能抑制該作用,因此認(rèn)為cAMP信號(hào)分子參與了后適應(yīng)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡信號(hào)的機(jī)制,即后適應(yīng)通過(guò)增加該信號(hào)組分抗凋亡、保護(hù)心肌。

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