王 茜， 鄧鳳君， 林煥冰， 徐江平△

(1南方醫(yī)科大學藥學院神經(jīng)藥理課題組，廣東廣州510515;2益陽醫(yī)學高等專科學校藥理教研室，湖南益陽413000)

再灌注治療是急性心肌梗死的重要治療手段。然而再灌注治療在迅速恢復缺血心肌的血流、挽救大量瀕死心肌的同時也導致心肌明顯損傷，即“缺血再灌注損傷 (ischemia reperfusion injury，I/R)”。缺血再灌注損傷的發(fā)生降低了臨床治療效果。建立減少缺血再灌注損傷的治療方案是最近30年急性心肌梗死治療的重要研究方向。有研究發(fā)現(xiàn)，在心臟缺血發(fā)生之前進行缺血預適應干預可以發(fā)揮心臟保護作用，但由于缺血事件不可預知性，該措施則難以應用。近年大量實驗研究與臨床應用表明，在心肌缺血后、恢復長期血流之前，進行一次或數(shù)次短暫重復的缺血/再灌注處理，即缺血后適應(ischemic postconditioning)能提高缺血心肌對之前發(fā)生的較長時間缺血的耐受性。與預適應相比，它具有更好的可預測性和臨床可控性［1］。但缺血后適應也可能會導致潛在的并發(fā)癥。因而有學者提出“藥物后適應”，即通過使用模擬內源性機制的藥物來發(fā)揮后適應的保護作用。而應用藥物后適應則需要對后適應的機制進行研究。

第二信使環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)參與對心臟廣泛的細胞功能和形態(tài)學過程，包括心肌變力狀態(tài)、變時性、凋亡和肥大的調節(jié)過程。且有研究發(fā)現(xiàn)活化腺苷酸環(huán)化酶(adenyl cyclase，AC)/cAMP通路的藥物能引出缺血心肌的延遲保護作用［2］。但cAMP在后適應中的作用還不是很清楚。因此我們采用離體心臟灌流模型，觀察后適應對心臟組織的保護作用，以及AC抑制劑SQ22536和磷酸二酯酶4(phosphodiesterase 4，PDE4)抑制劑洛利普蘭(rolipram)對后適應的影響，探討cAMP在后適應保護心臟中的作用。

材料和方法

1 材料

Sprague－Dawley(SD)大鼠(210－260 g)由廣州南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號為粵檢證字第2006－0015號;PCLab生物信號采集處理系統(tǒng)(北京微信斯達科技發(fā)展有限公司);肌酸激酶(creatine kinase，CK)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)測試盒均購自南京建成生物工程研究所，洛利普蘭和SQ22536購自Sigma－Aldrich。

2 方法

2．1 實驗分組與模型建立 51只大鼠隨機分為6組。2.5%戊巴比妥鈉 (50 mg/kg)腹腔注射麻醉，舌下靜脈注射肝素1 000 IU/kg抗凝。開胸迅速取心臟，置于4℃改良K－H液中，排盡殘血后經(jīng)主動脈將心臟懸掛于Langendorff灌流裝置上，用37℃經(jīng)混合氣(95%O2和5%CO2)平衡的K－H緩沖液行主動脈逆行灌流(灌注壓為80 cmH2O)。K－H液成分(mmol/L):NaCl 118，KCl 4.7，CaCl21.25，MgSO41.2，NaHCO325，KH2PO41.2，glucose，11.1。實驗分組:(1)正常組(control，n=8):K－H液持續(xù)灌流120 min;(2)缺血再灌注組(I/R group，n=11):以K－H液平衡15－20 min，37℃停灌45 min，再灌注60 min;(3)后適應組(post，n=10):再灌前給予6個循環(huán)的30 s I/30 s R;(4)缺血再灌注后適應+洛利普蘭組(post+roli 10μmol/L，n=8):以KH液平衡15 －20 min，改用含10μmol/L洛利普蘭的K－H液灌流10 min，停灌45 min，行后適應處理并再灌注60 min;(5)缺血再灌注后適應+SQ22536組(post+SQ22536，n=7):以 K－H液平衡15－20 min，改用含500 mmol/L SQ22536的K－H液灌流10 min，停灌45 min，行后適應處理并再灌注60 min;(6)缺血再灌注+洛利普蘭組(I/R+roli，n=7):不行后適應處理，余下過程同缺血再灌注后適應+洛利普蘭組。

2．2 左室功能檢測 心臟復跳后，將一連接壓力換能器的球囊插入左心室，壓力換能器與PClab多導生理記錄儀相連，在電腦上連續(xù)記錄左室內壓變化，并計算左室發(fā)展壓(left ventricular developed pressure，LVDP)=最大心室內壓－最小心室內壓。同時記錄冠脈流量(coronary flow，CF)。

2．3 組織病理學檢查 再灌60 min后取少許心臟組織4%甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下進行形態(tài)學檢查。

2．4 冠脈流出液酶學檢測 分別于停灌前、再灌流60 min時收集冠脈流出液以測定其中LDH和CK含量(按試劑盒說明操作)。

2．5 Total RNA抽提及 real－time PCR 再灌流60 min后取心肌組織，用Trizol試劑提取總RNA，取3μg逆轉錄合成cDNA。應用Primer 5.0引物設計軟件進行引物設計。各基因引物序列如下:β－actin正義鏈 5'－AGAGGGAAATCGTGCGTGAC －3'，反義鏈5'－CCATACCCAGGAAGGAAGGCT－3';caspase－3正義鏈 5'－GGAGCAGAGCCATGGGCACG －3'，反義鏈5'－GCACAGACGCCCTGATGGGG －3';bax正義鏈5'－GGCCCACCAGCTCTGAACAG －3'，反義鏈5'－ GCAATCATCCTCTGCAGCTCCATATTA －3';bcl－2正義鏈5'－ TGGAGAGCGTCAACAGGGAGATGTAC －3'，反義鏈 5'－ TGGAGAGCGTCAACAGGGAGATGTAC－3'。用Oligo dT18引物逆轉錄獲得總cDNA，實施實時熒光定量PCR反應。以ΔCt表示目的基因與β－actin Ct值的差值、ΔΔCt表示對照組與處理各組 ΔCt的差值，2－ΔΔCt反映目的基因mRNA的相對含量。

3 統(tǒng)計學處理

計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(ˉx±s)表示，采用SPSS13.0軟件處理，組間顯著性檢驗采用單因素方差分析和LSD檢驗。

結 果

1 I/R對離體心臟的影響

將離體心臟37℃停灌30、40和45 min，以模擬在體心臟缺血缺氧。結果顯示隨著停灌時間的延長，LVDP恢復率隨之下降，分別由79.61%減至61.45%，54.15%和37.71%。停灌45 min時，CF也顯著減少(P＜0.05)，見圖2。冠脈流出液中LDH和CK分別由352.12 U/L和1.90 kU/L增至615.71 kU/L和2.61 kU/L(P＜0.05)。并且心肌組織內凋亡調節(jié)基因caspase－3表達以及bax/bcl－2比值顯著增高，見圖5、6。組織病理學檢查顯示:I/R處理組心肌細胞排列雜亂，橫紋模糊不清或消失，細胞腫脹并出現(xiàn)明顯空泡樣變性、嗜酸性變及凝固性壞死，見圖7B。說明該離體心臟灌流模型可以模擬心肌I/R、具有可行性。

2 后適應對離體I/R心臟功能的保護作用

再灌流60 min后將LVDP和CF進行比較，后適應處理能顯著增加LVDP(圖1)和CF(圖2)。停灌前各組冠脈流出液中CK及LDH活性差異無顯著。后適應處理能顯著降低冠脈流出液中CK及LDH活性(圖3和4)。檢測再灌流60 min后心肌組織內凋亡相關基因，也得到相似結果，即后適應處理能顯著降低心肌組織內caspase－3 mRNA表達(圖5)和bax/bcl－2(圖6)比值。組織病理學檢查可見后適應組部分空泡樣變性及嗜酸性變，但細胞損害程度明顯低于I/R組(圖7)。

Figure 1．Effects of different treatment on LVDP recovery rate．I/R:ischemia/reperfusion;post:postconditioning;roli:rolipram;SQ:SQ22536．ˉx±s．n=7－11．*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs I/R group;△P＜0.05 vs post group．圖1 不同處理對LVDP恢復率的影響

Figure 2．Effects of different treatment on coronary flow(CF)．Values were expressed as the percentages of CF measured during equilibrium．ˉx±s．n=7－11．*P＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs I/R group;△P ＜0．05 vs post group．圖2 不同處理對CF的影響

Figure 3．Effects of different treatment on LDH release into coronary artery flow．ˉx±s．n=7－11．*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs I/R group;△P ＜0.05 vs post group．圖3 不同處理對心肌缺血再灌時冠脈流出液LDH釋放的影響

Figure 4．Effects of different treatment on CK release into coronary artery flow．ˉx±s．n=7－11．*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs I/R group;△P ＜0.05 vs post group．圖4 不同處理對心肌缺血再灌時冠脈流出液CK釋放的影響

Figure 5．Effects of different treatment on caspase－3 mRNA expression in myocardium．ˉx±s．n=6．*P＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs I/R group;△P ＜0.05 vs post group．圖5 不同處理對心肌缺血再灌時心肌組織caspase－3 mRNA表達的影響

Figure 6．Effects of different treatment on bcl－2/bax ratio in myocardium．ˉx±s．n=6．*P＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs I/R group;△P ＜0.05 vs post group．圖6 不同處理對心肌缺血再灌時心肌組織bcl－2/bax的影響

3 cAMP參與后適應對離體I/R心臟的保護作用

10μmol/L PDE4抑制劑洛利普蘭能顯著增強后適應對心臟的保護作用，表現(xiàn)為:與后適應組相比，LVDP顯著增高(圖1)及CF顯著增加(圖2)，冠脈流出液中LDH和CK活性均更為降低，見圖3、4。心肌組織內凋亡相關基因檢測結果也顯示洛利普蘭能進一步增強后適應的作用，即caspase－3 mRNA表達減少(圖5)、bax/bcl－2(圖6)比值降低。而 AC抑制劑SQ22536則能減弱/取消后適應對心臟的保護作用，LVDP顯著降低(圖1)及CF顯著減少(圖2)，冠脈流出液中LDH和CK活性均增高(圖3、4)、心肌組織內caspase－3 mRNA表達增加(圖5)、bax/bcl－2(圖6)比值上升。并且單用洛利普蘭則不能表現(xiàn)出心臟的保護作用，LVDP、CF、酶學指標和凋亡相關基因結果均顯示與I/R組無顯著差別。組織病理學檢查可見后適應與洛利普蘭共同處理能減輕心肌組織變性及其它病理改變程度，而后適應與SQ22536共同處理則組織損害程度重于后適應組，見圖7。

討 論

缺血再灌注被認為是多因素參與、非抗原依賴性的炎癥反應過程。臨床上，心肌I/R常常引起心律失常、心肌頓抑、心肌冬眠、無復流、心肌細胞損傷、LDH及CK釋放增加和心功能障礙等病理生理變化［3］。本研究顯示，對 Langendorff心臟灌流［4］進行停灌/復流處理，使其出現(xiàn)了LVDP降低和CF減少、心肌LDH和CK釋放增加、凋亡/抗凋亡基因表達異常、組織病理學變化，并且凋亡基因mRNA表達增高、抗凋亡基因表達降低。這些結果均與前人一致，說明該離體心臟灌流模型可以用來模擬心肌I/R。

Figure 7．The pathological examination of myocardium in different groups(HE staining，×l00)．A:control;B:I/R;C:post;D:post+roli;E:post+SQ;F:I/R+roli．圖7 各處理組心臟組織學改變

缺血后適應是一種在心肌再灌注時進行干預的保護措施，2003年Zhao等［5］首次報道了這種干預可導致心臟梗塞面積減少。隨后大量研究在其它種屬的動物如大鼠［6］、小鼠［7］及家兔［8］也證明了缺血后適應具有保護心臟的能力，甚至在臨床實施經(jīng)皮冠脈介入治療的病人實行數(shù)次短暫的球囊擴張也能夠減輕缺血損傷并改善心肌的灌注。目前對于缺血后適應介導心臟保護的機制尚未完全弄清。本研究采用了特異性PDE4抑制劑洛利普蘭和AC抑制劑SQ22536兩個工具藥來觀察cAMP在后適應介導心臟保護機制中的作用。結果顯示洛利普蘭能進一步地增強后適應的保護作用，而SQ22536則抑制了該保護作用。另一方面，洛利普蘭在沒有進行后適應干預時并未表現(xiàn)出其保護I/R心臟的作用，也說明了并不是由于cAMP自身濃度增高發(fā)揮作用的，該結果與前人研究理論一致，即PDE4抑制劑只有在心肌受刺激的狀態(tài)下影響心肌興奮性，而單獨應用其并不能保護缺血心?。?］。而后適應這種保護性刺激在cAMP濃度改變時作用增強或減弱，說明cAMP確實參與了后適應對I/R心臟的保護機制。

關于I/R引起的心肌細胞凋亡最初見于1994年Gottlieb等［10］的報道，隨后越來越多的動物實驗和臨床病理標本均證實I/R導致細胞凋亡的產(chǎn)生。也有不同研究發(fā)現(xiàn)缺血預適應、缺血后適應均表現(xiàn)出一定的抗心肌細胞凋亡效應［11，12］。細胞凋亡過程的分子調控機制非常復雜，其中bcl－2基因具有抗凋亡作用，而bax基因則可對抗Bcl－2蛋白抗凋亡的作用，細胞中bax和bcl－2 mRNA比值決定了細胞是否發(fā)生凋亡。Caspase－3位于Bcl－2和Bax的下游，是凋亡事件的最終效應酶，有研究表明它在心肌I/R損傷中發(fā)揮著非常重要的作用。因此本研究中主要對caspase－3 mRNA表達情況和bax/bcl－2比值進行觀察，并且再次證實了缺血后適應具有抗心肌細胞凋亡并改善心功能的作用。而且采用洛利普蘭能增強后適應的抗凋亡作用，而SQ22536能抑制該作用，因此認為cAMP信號分子參與了后適應調節(jié)心肌細胞凋亡信號的機制，即后適應通過增加該信號組分抗凋亡、保護心肌。

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