繆小輝 宋勇 呂鏜烽 展平 呂艷玲 袁冬梅

AKT2是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的重要亞型之一，AKT2通過PI3K/AKT細胞信號通路，調控細胞增殖、分化及生存[1]。大量證據(jù)[2,3]表明，AKT2與腫瘤細胞增殖和轉移過程密切相關，在多種腫瘤組織中都存在AKT2蛋白的過度表達。目前AKT2在肺癌中表達及與患者臨床病理特征的關系已有相關研究[4]，但與患者預后關系的臨床報道很少。本研究采用免疫組化方法檢測肺癌組織及肺良性病變組織中的AKT2水平，旨在分析AKT2表達及其與肺癌患者的臨床特征及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 標本 組織標本由南京胸科醫(yī)院以及南京軍區(qū)南京總醫(yī)院提供，2001年1月-2003年12月收集的95例原發(fā)性非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）以及10例對照組肺良性病變（1例肺結核、5例支氣管擴張、3例肺大皰、1例炎性假瘤）的手術組織標本，其中15例失訪，共80例納入本研究，術前均未經(jīng)放化療。腫瘤組織學TNM分期基于2009版UICC分類法重新分期，包括42例腺癌和38例鱗癌。這項研究得到南京軍區(qū)南京總醫(yī)院倫理委員會同意。

1.2 方法 采用免疫組織化學染色方法（EnVision），按常規(guī)程序脫蠟和復水。通過特定兔抗人AKT2單克隆抗體（Santa Cruz公司）（用PBS液稀釋成1:100）孵化過夜。PBS液沖洗后，加入山羊抗兔二抗體（二步法抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒 丹麥Dako公司）孵化30 min。PBS液沖洗后，切片用DAB顯色劑（北京中杉金橋公司）孵化30 min。用蘇木素（北京中杉金橋公司）進行復染。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。AKT2細胞質染色結果按Remmele評分系統(tǒng)[5]來計算，計算陽性細胞（顯棕黃色）染色密度與百分率。隨機選取5個高倍鏡視野，每個視野計數(shù)100個細胞，計算陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比，取5個視野的算術平均值。根據(jù)顯色細胞的比例計分：5個視野的顯色癌細胞百分比的算術平均值＜5% 為（-），5%-25%為（+），25%-50%為（++），＞50%為（+++）。超過5%為陽性，＜25%（--+）為低表達組，＞25%（++-+++）為高表達組。

1.3 統(tǒng)計及分析 80例NSCLC患者從手術日期開始隨訪，至患者死亡結束，至2009年5月1日仍然生存及無疾病進展者以60個月計算。實驗結果采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理，采用χ2檢驗及Fisher's精確概率檢驗、Kaplan-Meire生存分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 NSCLC及肺良性病變組織的AKT2表達（圖1） 免疫組化染色顯示，AKT2定位于NSCLC和肺良性病變組織細胞質中，表達程度如肺良性病變（肺大皰）組織AKT2陰性表達組（圖1A），肺腺癌AKT2低表達組（圖1B）及肺鱗癌AKT2高表達組（圖1C）。

在80例NSCLC中，AKT2表達陽性為46例（陽性率為57.50%），對照組10例肺良性病變組織中，AKT2表達陽性為1例（陽性率為10.0%），兩組存在統(tǒng)計學差異（χ2=8.038, P=0.006）。

2.2 AKT2蛋白在NSCLC組織中的表達及其與臨床特征的關系 由表1可見，AKT2表達與臨床特征無明顯相關性（P＜0.05）。

2.3 AKT2與NSCLC的無疾病進展生存期（progression-free survival, PFS）和總生存期（overall survival, OS）關系 至隨訪結束時，生存人數(shù)為28例，生存率為35.00%。無疾病進展生存人數(shù)為19例。腫瘤中AKT2陽性表達與患者的PFS及OS相關（PFS: χ2=12.761, P=0.005; OS: χ2=9.851,P=0.021）（表2）。

整體P F S中位時間為1 7個月（9 5%C I:10.182-23.818），OS中位時間為35個月（95%CI:20.975-49.025）。AKT2表達陰性組中，PFS中位時間為36個月（95%CI: 17.428-54.572），OS中位時間為45個月（95%CI: 38.078-51.040）；AKT2表達陽性組中，PFS中位時間為12個月（95%CI: 9.529-14.417），OS中位時間為22個月（95%CI: 16.308-27.692）。結果提示：AKT2陰性組的PFS和OS中位時間明顯長于陽性組。AKT2表達陽性組PFS明顯低于陰性組（χ2=9.893，P=0.002，圖2A），同樣兩組的OS存在明顯差異（χ2=9.611，P=0.002，圖2B），AKT2陽性組預后明顯差于陰性組。

圖1 AKT2在非小細胞肺癌以及良性病變組織中的表達（DAB, ×400）。A：AKT2在肺良性病變（肺大皰）組織中陰性表達；B：AKT2在肺腺癌組織中低表達；C：AKT2在肺鱗狀細胞癌組織中高表達。Fig 1 Expression of AKT2 in NSCLC and benign lung specimens (DAB, ×400). A: Negative expression of AKT2 in benign lung specimen (pulmonary bullae); B: Low-expression of AKT2 in adenocarcinoma; C: High-expression of AKT2 in squamous cell carcinoma.

圖2 AKT2表達與非小細胞肺癌患者無進展生存期（A）及總生存期（B）的Kaplan-Meier生存曲線Fig 2 Kaplan-Meier survival curve of expression of AKT2 in 80 patients with NSCLC.Survival curves (PFS) are stratified by negative and positive AKT2 expression (A); Survival curves (OS) are stratified by negative and positive AKT2 expression (B).

表1 AKT2表達與患者臨床特征的關系Tab 1 Relationship between the expression of AKT2 and characteristics of 80 patients with NSCLC

表2 AKT2表達與患者PFS及OS的關系Tab 2 Relationship between the expression of AKT2 and PFS and OS of patients with NSCLC

3 討論

肺癌是癌癥相關死亡的首要原因，其發(fā)病率逐年上升，但目前仍然沒有充分有效的治療手段，5年生存率僅為15%左右。

AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，此酶有3種異構體，分別為AKT1、AKT2和AKT3，是PI3K信號傳導通路下游因子[6]。PI3K家族參與多種信號通路，調節(jié)細胞的主要功能。正常情況下，由其活化而產(chǎn)生的類脂產(chǎn)物3,4-二磷酸磷脂酰肌醇[PI(3,4)P2]和3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇[PI(3,4,5)P3]作為第二信使結合并激活多種細胞內的靶蛋白，形成一個信號級聯(lián)復合物，最終調節(jié)細胞的增殖、分化、存活和遷移等。AKT在PI3K作用下發(fā)生磷酸化，磷酸化AKT水平增加可導致細胞生存通路PI3K/AKT的進一步活化，AKT主要介導體內PI3K依賴的細胞粘附、運動、侵襲和轉移[7]。AKT2是絲氨酸/蘇氨酸激酶的重要亞型之一，調控細胞增殖、分化及生存[1]。許多研究[8,9]表明人類腫瘤組織中存在AKT2基因擴增和mRNA過表達，卵巢癌和胰腺癌中得到證實。AKT2已被認為是癌基因，PI3K/AKT成為抗調亡的通路之一[10]。AKT2與腫瘤細胞轉移和增殖過程密切相關。

我們研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC組織中AKT2表達陽性率明顯高于肺良性病變組織，說明在肺癌組織中存在著AKT2的過度表達。劉紅等[11]研究報道的結果和本研究結果相似，他們同樣運用免疫組化的方法檢測NSCLC標本中AKT2表達陽性率增高。AKT2表達與NSCLC臨床特征無相關性。

同時，本研究結果中，AKT2表達與NSCLC患者PFS及OS存在密切的相關性，AKT2陽性組的患者預后明顯差于陰性組，提示AKT2在NSCLC的進展、轉移中起著重要的作用，AKT2表達直接影響NSCLC患者預后，AKT2可作為NSCLC患者預后差的預測因子。

生物學標志物的不斷發(fā)現(xiàn)，為NSCLC的診斷和治療提供了重要線索。PI3K/AKT信號通路對于細胞增殖、分化和調亡的調節(jié)起著重要的作用，目前對該信號通路在腫瘤侵襲轉移中的作用機制已基本明確，以哌立福新（perifosine）為代表的脂類抑制劑是目前抑制AKT的抗腫瘤藥物，對肺癌治療效果的臨床II期試驗正在進行中[12]。AKT2將有望成為肺癌治療的新靶點，通過一些小分子阻制劑對AKT2選擇性抑制將成為未來肺癌治療的新途徑[13]。相信不久的將來，以PI3K/AKT通路為靶點的小分子藥物將有望應用于肺癌的臨床治療中。

總之，我們通過免疫組化的方法檢測NSCLC組織及肺良性病變組織中AKT2蛋白的表達情況，分析發(fā)現(xiàn)AKT2蛋白的表達與患者臨床特征及預后密切相關，對判斷NSCLC患者預后具有重要意義。