王偉強(qiáng) 劉紅雨 宋志濤 王玉麗 王競 李穎 李永文 王岷 陳軍 周清華

血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）家族有三個(gè)受體，即VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3。VEGFR1募集造血干細(xì)胞并促進(jìn)單個(gè)核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞遷移；VEGFR2參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能；VEGFR3參與調(diào)節(jié)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的功能。VEGFR2介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移、存活和通透性增加，從而促進(jìn)血管新生，參與胚胎發(fā)育、損傷修復(fù)和許多疾病的發(fā)展進(jìn)程[1]。最近的研究[2]顯示，VEGFR2參與結(jié)腸炎向結(jié)腸癌的演變過程，長期慢性炎癥導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞表達(dá)VEGFR2增多。特異性阻斷VEGF和VEGFR2之間相互作用的人源抗體r84對(duì)肺癌動(dòng)物模型顯示出良好的抗腫瘤活性[3]。如何阻斷腫瘤組織的血管新生已經(jīng)成為腫瘤治療研究的熱點(diǎn)之一，VEGFR2是抗血管新生重要的靶分子[4]。在活體內(nèi)縱向研究腫瘤血管新生有很多限制，如為了觀察腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記分子VEGFR2的表達(dá)情況，通常需要在不同的時(shí)間點(diǎn)處死小鼠取出腫瘤組織進(jìn)行免疫組化檢測，使研究的持續(xù)性和一致性不能得到保證。以非侵害性的方式在活體內(nèi)追蹤VEGFR2表達(dá)的變化情況將對(duì)抗腫瘤血管新生研究提供極大的便利。

美國Xenogen公司將luc報(bào)告基因“敲入”VEGFR2基因啟動(dòng)子下游，使VEGFR2的表達(dá)能夠驅(qū)動(dòng)luc的表達(dá)，然后將Vegfr2-luc基因片斷導(dǎo)入小鼠染色體，成功制備Vegfr2-luc轉(zhuǎn)基因小鼠，利用活體成像技術(shù)能以非侵害性的方式追蹤Vegfr2-luc轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)VEGFR2的表達(dá)情況[5]。有兩個(gè)研究小組[6,7]應(yīng)用Vegfr2-luc轉(zhuǎn)基因小鼠分別對(duì)松弛素（relaxin）和接合纖維素的VEGF（fibrin-conjugated）的促血管新生作用進(jìn)行了研究，表明Vegfr2-luc轉(zhuǎn)基因小鼠是研究體內(nèi)血管新生的良好工具。Angst等[8]應(yīng)用Vegfr2-luc轉(zhuǎn)基因小鼠制備了胰腺癌原位腫瘤模型，并使用IVIS活體成像系統(tǒng)實(shí)時(shí)檢測了胰腺癌的血管新生情況。天津市肺癌研究所從美國Xenogen公司引進(jìn)Vegfr2-luc轉(zhuǎn)基因小鼠兩對(duì)，進(jìn)行繁育并鑒定，擬用于肺癌和其它腫瘤血管新生方面的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設(shè)備 IVC設(shè)施（智能型）購自蘇州市馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司；小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)（IVIS 200 Living Imaging System）購自美國XENOGEN公司；7900實(shí)時(shí)定量PCR（real-time PCR）儀購自美國ABI公司；連續(xù)光譜酶標(biāo)儀購自美國Molecular Devices公司；凝膠成像系（ChemiDoc XRS System）購自美國Bio-Rad公司；臺(tái)式微型離心機(jī)（Microfuge 18）購自美國Beckman Coulter公司；超凈臺(tái)購自中國Airtech公司；微量移液器（P-2.5, P-10,P-100, P-200, P-1000）購自德國Eppendorf公司；高壓滅菌器HVP-50購自日本Hirayama公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Vegfr2-luc轉(zhuǎn)基因小鼠，雄鼠為純合（nu/nu），雌鼠為雜合（nu/+），購自美國Xenogen公司。

1.1.3 試劑 總RNA提取試劑Trizol Reagent購自美國Invitrogen公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、隨機(jī)引物、RNase抑制劑、dNTP mix和熒光素酶檢測試劑盒（Luciferase Assay System）購自美國Promega公司；DNA Marker DL2000購自日本TAKARA公司；熒光素（D-Luciferin Firefly）購自美國Xenogen公司；小鼠全價(jià)營養(yǎng)顆粒飼料購自維通利華公司；蛋白酶K購自北京天根公司；VEGFR2實(shí)時(shí)定量PCR引物、Goldview核酸染料購自北京賽百盛公司；瓊脂糖粉購自美國Sigma公司；SYBR GREEN Master Mix和八聯(lián)管購自美國ABI公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國PIERCE公司；無RNase無菌包裝槍頭、槍頭盒、EP管及PCR管購自美國AXYGEN公司；無水乙醇、異丙醇、三氯甲烷、EDTA、氯化鈉等均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)小鼠的飼養(yǎng)和管理 Vegfr2-luc轉(zhuǎn)基因小鼠飼養(yǎng)在IVC設(shè)施內(nèi)，每周飼喂、換飲、清潔2次。記錄轉(zhuǎn)基因小鼠每胎出生個(gè)數(shù)、成活率及生長發(fā)育情況。

1.2.2 小鼠組織DNA提取 小鼠出生21天離乳分籠時(shí)剪取小鼠尾巴（約0.5 cm），加入600 μL TNES（10 mM Tris pH7.5, 400 mM NaCl, 100 mM EDTA, 0.6%SDS）和18 μL蛋白酶K（20 mg/mL）55oC孵育24 h；加入166.7 μL 6 M NaCl，劇烈震蕩15 s后12,000 rpm離心5 min；取出上清，加入等體積冰上預(yù)冷的95%乙醇，12,000 rpm離心5 min；棄去上清，加入0.5 mL 70%乙醇漂洗，12,000 rpm離心5 min；沉淀即為小鼠基因組DNA。棄去上清，待沉淀風(fēng)干后加入200 μL滅菌去離子水溶解，測DNA濃度，置于-20°C冰箱備用。

1.2.3 PCR鑒定luc+小鼠 取小鼠基因組DNA 100 ng作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。Luc基因引物序列：上游為5'-TGGATTCT AAAACGGATTACCAGGG -3'，下游為5'-CCAAAACAACA ACGGCGGC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為1,000 bp。內(nèi)參β-globulin引物序列：上游為5’-CAGACGCCACTGTCGCTTT-3’，下游為5’-TGTCTTTGGAACTTTGTCTGCAA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為500 bp。PCR反應(yīng)條件：94.5oC、40 S；58oC、1.5 h；72oC、1.5 h，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。取PCR產(chǎn)物10 μL在1%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像儀上觀察并成像。

1.2.4 小鼠活體熒光成像 異氟烷吸入性麻醉Vegfr2-luc轉(zhuǎn)基因小鼠，腹腔注射熒光素（luciferin）150 mg/kg，10 min后應(yīng)用IVIS200活體成像系統(tǒng)進(jìn)行成像，IVIS活體成像軟件分析成像結(jié)果。分別對(duì)3、4、6、8、10和15周齡Vegfr2-luc轉(zhuǎn)基因子代小鼠背側(cè)位和腹側(cè)位進(jìn)行全身成像（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)成像3只小鼠），曝光時(shí)間為20 s，為去除身體面積不同造成的偏差，取單位身體面積所發(fā)出的光子數(shù)為實(shí)驗(yàn)結(jié)果（p/s/cm2）。損傷修復(fù)模型建立后，每隔3天-4天對(duì)傷口成像一次，直到第21天損傷修復(fù)基本完成，曝光時(shí)間為1 s，傷口處熒光值的單位為p/s。

1.2.5 皮膚損傷修復(fù)模型的建立 取3只8周齡雌性Vegfr2-luc轉(zhuǎn)基因子代小鼠，將背部相應(yīng)部位皮膚的毛發(fā)剪掉，然后用剪刀剪去一塊直徑約為8 mm的圓形全層皮膚（包括上皮層、真皮層和皮下組織）。

1.2.6 小鼠各臟器組織蛋白中熒光素酶活性的測定 麻醉處死6只（雌雄各3只）8周齡轉(zhuǎn)基因子代小鼠，取肺、心、肝、腎、肌肉、子宮和睪丸等臟器。從各臟器中取100 mg組織置于研缽中，加入液氮，將其研磨成精細(xì)粉末；加入PLB（passive lysis buffer），在液氮和37°C水浴中反復(fù)凍融3次，以充分裂解蛋白；12,000 rpm離心4 min，收集上清，上清中即為組織蛋白。應(yīng)用BCA法測定組織蛋白濃度。蛋白定量后按照熒光素酶檢測試劑盒的說明檢測各臟器組織蛋白中熒光素酶的相對(duì)活性。

1.2.7 Real-time PCR檢測各臟器組織中VEGFR2 mRNA的表達(dá)水平 取獲取的各臟器組織100 mg，Trizol法提取總RNA，通過異丙醇沉淀法濃縮RNA，分光光度計(jì)定量，甲醛變性膠電泳檢測總RNA質(zhì)量。按照Promega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作合成cDNA。所用引物序列引自文獻(xiàn)[9]，由賽百盛生物公司合成。VEGFR2引物序列如下：上游5’-G CCCTGCTGTGGTCTCACTAC-3’，下游5’-CAAAGCATT GCCCATTCGAT-3’；內(nèi)參基因?yàn)樾∈驝yclophinin，引物序列為：上游5’-CAGACGCCACTGTCGCTTT-3’， 下游5’-TG TCTTTGGAACTTTGTCTGCAA-3’；按照ABI SYBR Green Master Mix試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料用Mean±SD，組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)分析采用直線相關(guān)?；騧RNA表達(dá)水平比較采用相對(duì)定量ΔΔCT值比較法進(jìn)行，ΔΔCt=[Ct GI（未知樣品）-Ct C y c l o p h i n i n（未知樣品）]-[Ct GI（校正樣品）-Ct C y c l o p h i n i n（校正樣品）]，平均相對(duì)含量= 2-averageΔΔCT。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)基因小鼠繁育狀況及l(fā)uc+新生小鼠的比例 轉(zhuǎn)基因小鼠在IVC設(shè)施內(nèi)生長繁育良好，每胎出生6只-10只不等，截止發(fā)稿時(shí)已繁育3代，共13胎，112只，成活率為100%。如圖1所示luc基因是1,000 bp，內(nèi)參β-globulin是500 bp。Luc+新生小鼠的比例為50%（56/112）。

2.2 轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)育過程中l(wèi)uc熒光值的變化情況 隨著鼠齡增長，各組小鼠腹側(cè)位和背側(cè)位活體成像所獲得的luc熒光值逐漸降低，不同周齡小鼠熒光值之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；15周齡轉(zhuǎn)基因小鼠與3周齡相比luc熒光值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），且已降至較低水平（圖2）。

2.3 轉(zhuǎn)基因小鼠各臟器luc活性和VEGFR2 mRNA的表達(dá)情況 雌性轉(zhuǎn)基因小鼠各臟器熒光素酶活性從高到低的順序依次為肺臟、子宮、腎臟、心臟、骨骼肌和肝臟，不同臟器luc活性的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；VEGFR2 mRNA的表達(dá)水平從高到低的順序依次為肺臟、子宮、腎臟、心臟、骨骼肌和肝臟，不同臟器VEGFR2 mRNA表達(dá)水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）（圖3）；各臟器熒光素酶活性和VEGFR2 mRNA的表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.948,P＜0.001）。雄性轉(zhuǎn)基因小鼠各臟器熒光素酶活性從高到低的順序依次為肺臟、睪丸、腎臟、心臟、骨骼肌和肝臟，不同臟器luc活性的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；VEGFR2 mRNA的表達(dá)水平從高到低的順序依次為肺臟、腎臟、心臟、睪丸、骨骼肌和肝臟，不同臟器VEGFR2 mRNA表達(dá)水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；將睪丸除外后，各臟器熒光素酶活性高低和VEGFR2 mRNA的表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.836, P＜0.001）。

圖1 PCR鑒定luc報(bào)告基因。M：DNA marker；1：luc-小鼠；2：luc+小鼠。Fig 1 Detection of luc reporter gene DNA marker. 1: luc- mice; 2: luc+ mice.

圖2 Vegfr2-luc轉(zhuǎn)基因小鼠生長發(fā)育過程中l(wèi)uc的表達(dá)情況。A：雌性Vegfr2-luc轉(zhuǎn)基因小鼠（n=3）分別在出生后的3、4、6、8、10和15周進(jìn)行腹側(cè)位和背側(cè)位成像，成像的顏色越靠近標(biāo)尺的上端，表明熒光信號(hào)越強(qiáng)；B：應(yīng)用活體成像分析軟件量化小鼠整個(gè)身體所發(fā)出的熒光值（p/s/cm2）。隨著鼠齡增長，luc表達(dá)量逐漸降低（P＜0.001）。Fig 2 Luc expression during postnatal development. A: Female Vegfr2-luc mice (n=3) at the ages of 3, 4, 6, 8, 10, and 15 weeks were imaged with IVIS in vivo living imaging system. Luciferase signal was collected from the dorsal and ventral sides of the mice. The color overlay on the image represents the photons per second emitted from the animal, as indicated by the color scales; B: Quantification of luc signal from the whole body with Living Image software (p/s/cm2). Luc expression in Vegfr2-luc transgenic mouse decreased with age (P＜0.001).

2.4 皮膚損傷修復(fù)過程中傷口處luc熒光值的變化情況 轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚損傷修復(fù)模型剛剛建立時(shí)，活體成像沒有檢測到luc熒光值，隨著傷口修復(fù)過程不斷推進(jìn)，luc熒光值不斷增加，第7天-第10天時(shí)達(dá)到峰值。隨著修復(fù)過程逐漸完成，luc熒光值逐漸降低，到第21天修復(fù)基本完成時(shí)，只能檢測到少量luc熒光信號(hào)。不同時(shí)間點(diǎn)luc熒光值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）（圖4）。

圖3 雌性8周齡Vegfr2-luc轉(zhuǎn)基因小鼠（n=3）各臟器luc活性和VEGFR2 mRNA的表達(dá)情況。A：轉(zhuǎn)基因小鼠各臟器組織蛋白的luc活性；B：Realtime PCR檢測各臟器組織中VEGFR2 mRNA的表達(dá)情況。各臟器VEGFR2 mRNA的表達(dá)水平與熒光素酶活性存在相關(guān)性（r=0.948, P＜0.001）。Fig 3 Vegfr2-luc expression in different tissues of 8-week female transgenic mice (n=3). A: Luc activity in different organs; B: Real-time PCR analysis of VEGFR2 mRNA expression in different organs. Luc activity correlated with VEGFR2 mRNA expression (r=0.948, P＜0.001).

3 討論

Vegfr2-luc轉(zhuǎn)基因小鼠基因組內(nèi)的VEGFR2是共顯性等位基因，其中一條等位基因的表達(dá)必然伴隨著另外一條等位基因的表達(dá)。Luc報(bào)告基因被插入到VEGFR2其中一條等位基因的第一個(gè)外顯子，VEGFR2的表達(dá)會(huì)驅(qū)動(dòng)luc報(bào)告基因的表達(dá)。因此，Vegfr2-luc轉(zhuǎn)基因小鼠的VEGFR2等位基因位點(diǎn)是雜合子（luc/VEGFR2），理論上新生小鼠中攜帶luc報(bào)告基因的比例為50%。PCR檢測新生小鼠DNA中的luc報(bào)告基因，新生小鼠中的50%攜帶luc報(bào)告基因，與理論值相符。

圖4 皮膚損傷修復(fù)過程中傷口處的luc表達(dá)情況。A：損傷修復(fù)過程中不同時(shí)間點(diǎn)的成像結(jié)果（n=3）。0天為損傷后立即成像，之后分別在損傷后的第1、4、7、10、14、17和21天進(jìn)行成像；B：應(yīng)用活體成像軟件量化傷口處的熒光值（p/s）。傷口處luc熒光值先逐漸增強(qiáng)后逐漸減弱 (P＜0.001)。Fig 4 Luc expression during wound-healing. A: The wound-healing model mice were imaged at selected time points (n=3). The day 0 image was taken immediately after wounding, and subsequent images were taken on days 1, 4, 7, 10, 14, 17, and 21 after wounding. B: Quantification of luciferase expression (p/s) from the wound area with Living Image software. Luc expression first increased, and then decreased in the wound area (P＜0.001).

VEGF與其受體VEGFR2的相互作用對(duì)小鼠胚胎發(fā)育以及出生后體內(nèi)的血管新生都起著至關(guān)重要的作用。小鼠出生后發(fā)育過程的早期階段伴有大量血管新生，VEGFR2的表達(dá)也相應(yīng)上調(diào)[1]。當(dāng)小鼠發(fā)育成熟后，血管新生明顯減少，VEGFR2的表達(dá)也降低。不同周齡Vegfr2-luc轉(zhuǎn)基因小鼠的活體成像結(jié)果顯示，發(fā)育早期小鼠luc報(bào)告基因的表達(dá)水平較高，隨著小鼠成熟度增加，luc報(bào)告基因的表達(dá)逐漸減少，到6周齡以后，表達(dá)處于一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的較低水平。Luc報(bào)告基因在成年雌性Vegfr2-luc轉(zhuǎn)基因小鼠的肺臟和子宮的表達(dá)水平較高，在其它檢測的臟器中的表達(dá)相對(duì)較低。成年雄性Vegfr2-luc轉(zhuǎn)基因小鼠的肺臟和睪丸luc報(bào)告基因的表達(dá)水平較高，其它臟器表達(dá)水平較低。將雄鼠的睪丸組織除外，成年Vegfr2-luc轉(zhuǎn)基因小鼠各器官組織中VEGFR2 mRNA的表達(dá)水平與luc報(bào)告基因的表達(dá)水平成正相關(guān)，這與XENOGEN公司發(fā)表的關(guān)于Vegfr2-luc轉(zhuǎn)基因小鼠的文獻(xiàn)[5]相一致。

通常將小鼠背部皮膚的全皮層（包括表皮、真皮和皮下組織）切除制備皮膚損傷模型，用于皮膚損傷修復(fù)過程或其它皮膚疾病的研究[10]。皮膚損傷誘導(dǎo)產(chǎn)生的過氧化氫（H2O2）能促進(jìn)VEGF和VEGFR2表達(dá)增加，從而促進(jìn)血管新生，有利于損傷修復(fù)[11]。與皮膚傷口修復(fù)的過程相一致，傷口處的血管新生會(huì)先增多后減少，直到修復(fù)完成。在Vegfr2-luc轉(zhuǎn)基因小鼠損傷修復(fù)模型建立后的第1天即能檢測到luc的表達(dá)，第7天-第10天時(shí)表達(dá)達(dá)到最高水平，第21天修復(fù)即將完成時(shí)仍有少量表達(dá)。這說明在轉(zhuǎn)進(jìn)因小鼠的損傷修復(fù)過程中，luc的表達(dá)伴隨著損傷修復(fù)過程中的血管新生。

綜上所述，新生Vegfr2-luc轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)luc報(bào)告基因的表達(dá)能夠示蹤體內(nèi)VEGFR2的表達(dá)情況，是在動(dòng)物水平非侵入性研究血管新生的有利工具。