張文穎 張為民 王林 鄭靜嫻 肖鋒

化療和表皮生長因子酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）是晚期非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的兩大主要治療手段，二者作用機(jī)制不同，理論上聯(lián)合應(yīng)用能產(chǎn)生增效作用，但多中心臨床研究[1,2]發(fā)現(xiàn)，化療藥物與EGFR-TKIs同時(shí)應(yīng)用在療效和生存上未優(yōu)于單獨(dú)化療，先化療后序貫應(yīng)用EGFR-TKIs才能產(chǎn)生協(xié)同增效作用[3,4]。同時(shí)應(yīng)用未產(chǎn)生增效作用與EGFR-TKIs使細(xì)胞周期發(fā)生變化、降低細(xì)胞對化療藥物敏感性有關(guān)[5,6]。但先化療后序貫應(yīng)用EGFR-TKIs產(chǎn)生協(xié)同增效作用與細(xì)胞周期變化無關(guān)[7,8]，其確切細(xì)胞學(xué)機(jī)制有待闡明。

EGFR-TKIs通過抑制EGFR及其下游信號磷脂酰肌醇三羥基激酶/蛋白激酶B（phosphatidyl inositol -3-kinase and protein kinase B, PI3K/Akt）和絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（mitogen-activated protein kinases/extra cellular signal-regulated kinases, MAPK/Erk1/2）傳導(dǎo)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡。 既往的研究[8,9]顯示，化療藥物與EGFR-TKIs均可影響EGFR及其下游信號傳導(dǎo)蛋白表達(dá)，在因EGFR T790M突變對EGFR-TKIs產(chǎn)生繼發(fā)耐藥的NSCLC細(xì)胞中，化療后序貫應(yīng)用EGFR-TKIs產(chǎn)生協(xié)同增效作用與化療藥物影響EGFR磷酸化有關(guān)[10]，但對比例最高的EGFR野生型NSCLC細(xì)胞是否如此，目前未見報(bào)道。因此，本研究的第一個(gè)目的是應(yīng)用EGFR野生型人肺腺癌SPC-A1細(xì)胞研究化療藥物與EGFR-TKIs不同序貫用藥對細(xì)胞生長和EGFR及其下游信號傳導(dǎo)蛋白表達(dá)變化關(guān)系，探討二者序貫用藥增效在EGFR野生型NSCLC細(xì)胞的可能細(xì)胞學(xué)機(jī)制。

研究[11]發(fā)現(xiàn)，包括NSCLC在內(nèi)的多種惡性腫瘤均存在著胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor, IGF）1型受體（IGF-1R）表達(dá)，IGF-1R和EGFR都通過激活PI3K/Akt和MAPK/Erk促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長，在細(xì)胞信號傳導(dǎo)和生理功能上存在相互作用、相互依存關(guān)系。IGF-1R表達(dá)與細(xì)胞對化療及EGFR-TKIs敏感性相關(guān)[11,12]，干擾細(xì)胞IGF-1R表達(dá)或IGF-1R抑制劑可以提高NSCLC細(xì)胞對化療藥物及EGFR-TKIs的敏感性，其增加化療藥物敏感性與抑制PI3K/AKT關(guān)系密切[13,14]。反之，EGFR-TKIs影響IGF-1R表達(dá)[12]，化療藥物如多西他賽誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡機(jī)制亦包括了對IGF-1R的抑制[13,15]，化療與EGFR-TKIs序貫治療療效是否與二者對IGF-1R蛋白信號通路影響有關(guān)，目前國內(nèi)外未見報(bào)道。因此，本研究的第二個(gè)目的是檢測多西他賽和吉非替尼不同給藥時(shí)序?qū)θ朔蜗侔┘?xì)胞SPC-A1生長及細(xì)胞EGFR、ERK、AKT表達(dá)及磷酸化的影響，同時(shí)觀測其對IGF-1R表達(dá)的影響，以探索IGF-1R表達(dá)在其細(xì)胞學(xué)機(jī)制中的作用，為目前療效尚不理想的NSCLC探索新的治療方向提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌細(xì)胞SPC-A1由中科院上海細(xì)胞生物研究所提供。MTT、DMSO購自Sigma公司。吉非替尼和多西他賽分別由阿斯利康制藥有限公司及江蘇恒瑞公司提供，均溶于DMSO中，以5×10-3mol/L儲存于-20oC保存。IGF-1R一抗、β-actin、pEGFR一抗、ERK1/2一抗、pAKT一抗以及pERK1/2購自Cell Signaling公司，EGFR一抗、AKT一抗購自Santa Cruz公司，兔源及鼠源二抗購自Jackson Immuno公司，BCA試劑盒購自Pirce公司。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自GE Healthcare公司。DNA提取試劑盒購自天根生物公司。電泳儀及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)為Bio-Rad公司產(chǎn)品，酶聯(lián)免疫檢測儀為Biocell2010公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺腺癌細(xì)胞SPC-A1培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640（Gibco公司）培養(yǎng)液，常規(guī)置于37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中，細(xì)胞單層貼壁生長。實(shí)驗(yàn)取用生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化傳代，收集備用。

1.2.2 細(xì)胞SPC-A1中EGFR和K-ras基因突變的檢測 將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞胰酶消化，離心重懸后按基因組DNA提取試劑盒說明操作提取DNA。取細(xì)胞SPC-A1 DNA產(chǎn)物8 μL進(jìn)行電泳1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。細(xì)胞EGFR及K-ras突變檢測送由為真生物醫(yī)藥采用高分辨率溶解曲線分析技術(shù)（Quantitative PCR high-resolution melting,qPCR-HRM）完成。

1.2.3 MTT法檢測藥物對細(xì)胞SPC-A1生長作用影響 取100 μL對數(shù)生長的SPC-A1細(xì)胞，按5×103/孔接種至96孔培養(yǎng)板，每組4個(gè)平行復(fù)孔，細(xì)胞貼壁后，再按實(shí)驗(yàn)要求分別加入100 μL含有不同濃度的多西他賽和/或吉非替尼的培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間換含有不同藥物的培養(yǎng)基，用酶標(biāo)儀測定每孔細(xì)胞OD值。測定前向每孔內(nèi)加入MTT 20 μL（5 g/L），孵育4 h后棄上清，加入150 μL DMSO，振蕩15 min后酶標(biāo)儀測定492 nm波長下各孔吸光值。計(jì)算藥物作用細(xì)胞后存活率及其IC50值。實(shí)驗(yàn)分組如下：（1）對照組（無藥物作用）（C）；（2）多西他賽單獨(dú)作用72 h組（D）；（3）吉非替尼單獨(dú)作用72 h組（G）；（4）同時(shí)給藥組72 h（D+G）；（5）多西他賽作用24 h序貫吉非替尼48 h組（DG）；（6）吉非替尼作用48 h序貫多西他賽作用24 h（GD）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，生存率=（用藥組OD值-空白對照OD值）/（對照組OD值-空白對照OD值）。

1.2.4 Western blot檢測藥物對細(xì)胞信號蛋白的影響 細(xì)胞按設(shè)計(jì)分組給藥處理后，將原培養(yǎng)基連同胰酶消化下的細(xì)胞離心，冷PBS洗3次，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸化蛋白酶抑制劑的裂解液冰上提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，等量上樣，10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，一抗（1:400-1:1,000）4oC搖床孵育過夜，TBST洗膜10 min×3次，二抗（1:3,000）室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，ECL顯色后化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像。以Band Scan圖像分析軟件進(jìn)行積分光密度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組間差異分析采用One-way ANOVA檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SPC-A1細(xì)胞EGFR和K-ras基因狀況 采用qPCR-HRM對人肺癌SPC-A1細(xì)胞的EGFR基因18、19、20、21外顯子和K-ras基因2、3外顯子進(jìn)行突變檢測，結(jié)果顯示：樣本均與陰性對照一致，無突變，SPC-A1細(xì)胞EGFR和K-ras基因均為野生型（圖1）。

2.2 多西他賽與吉非替尼對SPC-A1細(xì)胞生長影響 正常培養(yǎng)的肺腺癌SPC-A1細(xì)胞生長呈無限繁殖，第2天進(jìn)入對數(shù)生長期（圖2）。 多西他賽與吉非替尼具抑制SPC-A1細(xì)胞生長作用，作用呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性。在一定濃度范圍，多西他賽（1×10-4mol/L-1×10-12mol/L）與吉非替尼（1×10-4mol/L-1×10-10mol/L）濃度依賴性抑制SPC-A1細(xì)胞生長（圖3）。多西他賽和吉非替尼作用72 h對SPC-A1細(xì)胞抑制作用的IC50值分別為1.96×10-7mol/L和2.01×10-5mol/L。

2.3 多西他賽與吉非替尼同時(shí)及序貫應(yīng)用對SPC-A1細(xì)胞生長影響 確定多西他賽和吉非替尼IC50值為兩藥同時(shí)及序貫應(yīng)用濃度，作用72 h。多西他賽與吉非替尼對細(xì)胞生長SPC-A1存活率分別為（圖4）：多西他賽組（D）57.32%；吉非替尼組（G）54.94%；吉非替尼和多西他賽同時(shí)作用組（G+D）54.30%；多西他賽序貫吉非替尼組（DG）43.27%；吉非替尼序貫多西他賽組（GD）55.16%。吉非替尼和多西他賽同時(shí)作用組（G+D）及吉非替尼序貫多西他賽（GD）對細(xì)胞生長的抑制作用與單藥組（G或D）無明顯差別（P＞0.05）。多西他賽序貫吉非替尼組（DG）對細(xì)胞生長的抑制作用明顯強(qiáng)于單獨(dú)作用及同時(shí)給藥組（P＜0.05）。

2.4 多西他賽與吉非替尼同時(shí)及序貫應(yīng)用對SPC-A1細(xì)胞EGFR、ERK、AKT表達(dá)及其磷酸化、IGF-1R表達(dá)的影響如圖5所示， 多西他賽和吉非替尼對SPC-A1細(xì)胞非磷酸化的EGFR、ERK及AKT表達(dá)無明顯影響；多西他賽和吉非替尼分別增強(qiáng)和抑制EGFR與ERK的磷酸化。相比多西他賽，多西他賽與吉非替尼同時(shí)應(yīng)用EGFR和ERK磷酸化無明顯變化，多西他賽誘導(dǎo)的EGFR和ERK磷酸化明顯被序貫的吉非替尼抑制。相比吉非替尼，吉非替尼序貫多西他賽對EGFR和ERK磷酸化無明顯變化。多西他賽與吉非替尼同時(shí)及序貫應(yīng)用對AKT及其磷酸化無明顯影響。多西他賽下調(diào)IGF-1R表達(dá)，吉非替尼對IGF-1R表達(dá)無明顯影響。相比多西他賽單藥，多西他賽序貫吉非替尼對IGF-1R表達(dá)無明顯變化。

3 討論

圖1 SPCA-1細(xì)胞EGFR和K-ras基因突變檢測Fig 1 Analysis of EGFR and K-ras gene mutation

圖2 SPC-A1細(xì)胞的生長曲線Fig 2 Proliferation curve of SPC-A1 cells

圖3 不同濃度吉非替尼和多西他賽對SPC-A1細(xì)胞生長的影響Fig 3 Effects of gefitinib and docetaxel on the proliferation of SPC-A1 cells

圖4 吉非替尼和多西他賽同時(shí)及序貫應(yīng)用對SPC-A1細(xì)胞生長的影響。C：對照組；D：多西他賽組；G：吉非替尼組；D+G：多西他賽吉非替尼同時(shí)作用組；DG：多西他賽序貫吉非替尼組；GD：吉非替尼序貫多西他賽組?！号c對照組相比，P＜0.05； ★：與D和G組相比，P＜0.05。Fig 4 Effect of different combinations of gefitinib and docetaxel on the proliferation of SPC-A1 cells. C: Without treatment; D: Docetaxel alone; G: Gefitinib alone; D+G: Docetaxel plus Gefitinib; DG: Docetaxel followed by Gefitinib; GD: Gefitinib followed by Docetaxel. ▲: compare to control group, P＜0.05; ★: compare to D and G groups, P＜0.05.

圖5 吉非替尼和多西他賽同時(shí)及序貫應(yīng)用對SPC-A1細(xì)胞信號蛋白表達(dá)的影響Fig 5 Effect of different combinations of gefitinib and docetaxel on the signal transduction protein expression of SPC-A1 cells

本研究結(jié)果顯示，肺腺癌細(xì)胞株SPC-A1為EGFR野生型，多西他賽和吉非替尼在一定濃度范圍均呈濃度依賴性抑制SPC-A1細(xì)胞增殖，SPC-A1為非EGFR-TKI敏感性細(xì)胞株，吉非替尼對其抑制作用較多西他賽弱，與文獻(xiàn)[16,17]報(bào)道一致。基于以下原由選用EGFR野生型細(xì)胞來進(jìn)行研究：（1）既往發(fā)現(xiàn)化療序貫EGFR-TKIs具協(xié)同增效作用的基礎(chǔ)研究是來自EGFR野生型NSCLC細(xì)胞，臨床研究來自EGFR突變狀態(tài)未篩選的NSCLC患者；（2）EGFR-TKI對EGFR突變型細(xì)胞已具有很強(qiáng)的抑制能力，IPASS臨床研究[18]顯示吉非替尼對EGFR突變的NSCLC患者，有效率高達(dá)71%，化療和EGFR-TKI合理聯(lián)合應(yīng)用對敏感性較差的EGFR野生型患者意義尤為重要。

本研究結(jié)果顯示，先用多西他賽后序貫應(yīng)用吉非替尼對細(xì)胞的生長抑制作用較多西他賽單藥、吉非替尼單藥、二者同時(shí)應(yīng)用或先吉非替尼后序貫多西他賽明顯，具協(xié)同增效作用，結(jié)果與Rosetti等[19]的報(bào)道一致。INTACT1、INTACT2、TRIBUTE和TALENT的多中心隨機(jī)對照臨床研究[20,21]亦證實(shí)，對于EGFR突變狀態(tài)未篩選的晚期NSCLC患者，化療與EGFR-TKI同時(shí)應(yīng)用未優(yōu)于單獨(dú)化療。先化療再序貫EGFR-TKI能夠提高有效率，延長無疾病進(jìn)展期及肺腺癌患者總生存[4,22]。

已證實(shí)，EGFR-TKIs主要通過抑制PI3K-AKT和MARK/ERK這兩個(gè)EGFR信號傳導(dǎo)而抑制腫瘤細(xì)胞生長。本研究結(jié)果顯示，吉非替尼抑制SPC-A1細(xì)胞生長的同時(shí)抑制EGFR、ERK的磷酸化水平，但未改變AKT的磷酸化，說明吉非替尼是通過抑制Raf/MEK/ERK這個(gè)信號通路抑制SPC-A1腺癌細(xì)胞增殖，而非通過抑制PI3K/AKT傳導(dǎo)通路。對EGFR野生型的各種不同NSCLC細(xì)胞，吉非替尼對PI3K-AKT和Raf/MEK/ERK的抑制作用因細(xì)胞不同而異[9,23]。

對化療后序貫EGFR-TKIs協(xié)同增效作用的細(xì)胞學(xué)機(jī)制，既往的基礎(chǔ)研究顯示，在EGFR T790M突變對EGFRTKIs產(chǎn)生繼發(fā)耐藥的NSCLC細(xì)胞中，這種協(xié)同增效作用與化療藥物影響EGFR細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白表達(dá)相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，多西他賽能明顯誘導(dǎo)上調(diào)SPC-A1細(xì)胞EGFR、ERK磷酸化水平的結(jié)果與既往研究[24,25]一致。除多西他賽外，其它化療藥物如紫杉醇、順鉑、吉西他濱和培美曲塞亦能上調(diào)NSCLC細(xì)胞EGFR及其信號蛋白磷酸化[8,9,26]?；熕幬镎T導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EGFR及其信號蛋白磷酸化也在白血病、前列腺癌、黑色素瘤和食道癌等許多腫瘤中得到廣泛證實(shí)[27,28]?；熕幬镎T導(dǎo)腫瘤細(xì)胞信號蛋白磷酸化被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞通過增強(qiáng)EGFR/ERK信號通路的活化進(jìn)行增殖，逃避化療的殺傷作用的重要方式[28-30]。本研究發(fā)現(xiàn)，先用多西他賽后序貫吉非替尼的EGFR和ERK磷酸化水平明顯較多西他賽與吉非替尼同時(shí)應(yīng)用或單獨(dú)應(yīng)用多西他賽低，這種EGFR和ERK磷酸化水平的變化不伴有EGFR和ERK的增加，結(jié)果說明化療上調(diào)EGFR及ERK磷酸化，使吉非替尼抑制EGFR及ERK敏感性增強(qiáng)是化療序貫吉非替尼的協(xié)同增效作用的細(xì)胞學(xué)機(jī)制之一。這一結(jié)果與Giovannetti[8]和Van Schaeybroeck等[9]的發(fā)現(xiàn)一致，化療與EGFR-TKI聯(lián)合應(yīng)用于不同NSCLC細(xì)胞，只有細(xì)胞EGFR磷酸化（pEGFR）水平增加者才能從后續(xù)的吉非替尼治療中獲益，而與EGFR是否存在突變或擴(kuò)增無關(guān)。本研究結(jié)果顯示，相比多西他賽，吉非替尼與多西他賽同時(shí)應(yīng)用或先吉非替尼后序貫多西他賽對細(xì)胞生長無明顯影響，吉非替尼抑制EGFR和ERK磷酸化作用亦不能被同時(shí)或序貫應(yīng)用的多西他賽逆轉(zhuǎn)，結(jié)果說明多西他賽未增強(qiáng)吉非替尼抑制細(xì)胞生長作用可能與EGFR和ERK磷酸化水平低下有關(guān)。有研究[31]報(bào)道在結(jié)直腸癌細(xì)胞中下調(diào)EGFR磷酸化水平能導(dǎo)致EGFR-TKI與細(xì)胞毒化療藥物產(chǎn)生拮抗作用。

本研究SPC-A1細(xì)胞表達(dá)IGF-1R，與既往的報(bào)道[32]一致。化療藥物多西他賽能夠明顯抑制IGF-1R蛋白表達(dá)而吉非替尼對IGF-1R表達(dá)無影響，多西他賽與吉非替尼同時(shí)應(yīng)用或先多西他賽后序貫吉非替尼均下調(diào)IGF-1R蛋白表達(dá)，結(jié)果初步說明多西他賽序貫吉非替尼的協(xié)同增效作用可能與IGF-1R表達(dá)無關(guān)，是否與IGF-1R及其細(xì)胞信號蛋白磷酸化有關(guān)我們正進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

本研究結(jié)果初步顯示，化療序貫EGFR-TKI對EGFR野生型NSCLC增效作用機(jī)制與化療上調(diào)腫瘤細(xì)胞EGFR和ERK的磷酸化有關(guān)，與IGF-1R表達(dá)無關(guān)。值得一提的是，本研究只觀察了一種EGFR野生型細(xì)胞，有待在多種NSCLC細(xì)胞中加以證實(shí)。