武麗紅 王金河 王茜 賈懂懂 梁建琴

Survivin又名BIRC5，其是一種凋亡抑制蛋白，是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein, IAP）家族的成員，其通過抑制caspase活化而抑制凋亡或程序性細胞死亡。Survivin蛋白通常在人類胚胎組織和腫瘤細胞中高表達[1]，同時其表達受細胞周期的調(diào)控，僅在G2/M期高表達[2]。RNAi是在轉(zhuǎn)錄水平上控制基因表達的新技術(shù)[3]。本研究通過利用shRNA以慢病毒為表達載體沉默Survivin基因，研究其對A549細胞增殖的影響，從而為肺癌的基因治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料 慢病毒系列質(zhì)?！诵馁|(zhì)粒pLL3.7以及包裝質(zhì)粒pVSVG、pRSV-REV、pMDLg/pRRE均為本實驗室保存；293T細胞、Hela細胞和人肺癌細胞A549由協(xié)和醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學細胞中心提供；限制性內(nèi)切酶HpaI、XhoI、XbaI、NotI和T4連接酶購自New Englang Biolabs；StarFect High-efficiency Transfection Reagent購自GenStar；超濾離心管購自Millopore；總RNA提取試劑盒購自LC Sciences；Titan One Tube RT-PCR kit購自Roche；Survivin antibody、GAPDH、tubulin均購自Santa Cruz；mouse-HRP購自北京中杉金橋生物有限公司；ECL購自GE；流式細胞儀型號為Cytomics FC 500 Beckman Coulter。

1.2 方法

1.2.1 Survivin shRNA重組慢病毒的構(gòu)建及鑒定 根據(jù)homo spacies Survivin mRNA序列利用在線軟件設(shè)計2個19 bp的靶基因序列，分別為5′GACCACCGCATCTCTACA3′和5′GGCTGGCTTCATCCACTGC3′；Control靶序列為5′GCGAATTTAGGATAATCTC3′。在設(shè)計的寡核苷酸序列中，5′端為HpaI酶切位點，3’端為XhoI酶切位點，中間為9個堿基的loop結(jié)構(gòu)：TTCAAGAGA。序列由Invitrogen公司合成。寡核苷酸退火后與經(jīng)HpaI、XhoI線性化的pLL3.7質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化DH5α經(jīng)氨芐青霉素（Amp）平板篩選。挑取單克隆菌落質(zhì)粒小提，XbaI、NotI酶切鑒定同時送Invitrogen公司測序。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 293T細胞、Hela細胞和人肺癌細胞A549培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清和1%雙抗——青霉素與鏈霉素）。轉(zhuǎn)染293T細胞前24 h接種適量細胞至轉(zhuǎn)染時細胞密度60%為宜（6 cm培養(yǎng)皿）。轉(zhuǎn)染前1 h-4 h更換新鮮培養(yǎng)基，細胞均于37oC含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。取10 μg DNA（pLL3.7:pVSVG:pRSV-REV:pMDLg/pRRE=3:1:1:1）加入PBS至200 μL，輕輕混勻，室溫放置；取8 μL StarFect加入PBS至總體積200 μL，輕輕混勻，室溫放置5 min；將稀釋的StarFect逐滴加入稀釋的DNA溶液中，輕輕混勻，室溫放置15 min；將上述混合液逐滴加入培養(yǎng)基中，輕輕混勻。置于37oC含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48 h后收集病毒（轉(zhuǎn)染后6 h換新鮮培養(yǎng)基）。

1.2.3 Survivin shRNA病毒收集及滴度測定 轉(zhuǎn)染6 cm×6 cm培養(yǎng)皿，48 h后收集培養(yǎng)基，0.45 μm濾膜過濾，收集上清加入到超濾離心管中，5,000 rpm離心，過濾至終體積為200 μL，-80oC保存?zhèn)溆?。感染病?2 h-24 h前接種4×105個Hela細胞于6孔板中，并置于37oC含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分別用DMEM培養(yǎng)基將病毒按1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4進行梯度稀釋，同時加8 μg/mL的聚凝胺。吸去上清，分別加入不同稀釋度的病毒液體，每個濃度重復1次，同時設(shè)置不加病毒的陰性對照。48 h后觀察GFP的熒光表達率，選取熒光表達率1%-10%的稀釋度計算病毒滴度。病毒滴度=接種細胞數(shù)×稀釋度×熒光細胞百分比。

1.2.4 RT-PCR與Western blot A549細胞感染48 h后按照總RNA提取試劑盒說明書提取RNA，并進行RTPCR。Survivin引物序列：Forward: 5′CCCTGCCTGGCAGCCCTTTC3′，Reverse: 5′CTGGCTCCCAGCCTTCCA3′，擴增長度為188 bp。GAPDH引物序列：Forward: 5′AGAAGGCTGGGGCTCAGGTG3′；Reverse: 5′AGGGGCCATGGACAGTCTTC3′，擴增長度為258 bp。PCR擴增條件為：95oC 1 min，94oC 1 min，57oC 30 s，72oC 30 s，30個循環(huán)；72oC 10 min。取PCR產(chǎn)物3 μL進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。圖像采用Quantity One軟件分析灰度值。

A549細胞感染48 h后提取總蛋白，考馬斯亮藍G250法測定蛋白濃度后進行12%SDS-PAGE。72 V轉(zhuǎn)膜2 h，一抗Survivin和tubulin 4oC過夜，洗膜后室溫二抗1 h。ECL顯影。

1.2.5 MTT與流式細胞術(shù) 將A549細胞以每孔1,000-10,000個細胞接種到96孔板，每孔體積200 μL。細胞分為PBS組、實驗組與陰性對照組；病毒懸液按照1×10-2稀釋度加入。每組設(shè)3個平行。第2天時加病毒，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。每孔加Mヰ溶液（5 mg/mL，用PBS配制，pH7.4）20 μL。繼續(xù)孵育4 h。棄去培養(yǎng)基，每孔加150 μL DMSO，脫色搖床振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490 nm（570 nm）波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。實驗重復3次。

收集感染病毒48 h的A549細胞于離心管中，1,000 rpm離心3 min，棄上清液，輕彈細胞沉淀物。用5 mL PBS重懸細胞，離心洗1遍，棄上清液，重復同樣操作1次。輕彈細胞沉淀物，約0.2 mL-0.3 mL。固定：用細滴管將以上細胞懸液迅速注入4oC預冷的70%酒精中，輕輕混勻，4oC冰箱保存至少24 h。洗去固定劑：1,000 rpm離心3 min，去上清，輕輕彈起細胞沉淀物，加PBS后將細胞懸液輕輕混勻。1,000 rpm離心3 min。RNA酶消化：去上清，取0.5 mL細胞懸液，加入RNAse A，終濃度為50 μg/mL，37oC孵育30 min。將樣品管插入冰浴中，停止RNAse A的消化作用。碘化丙啶（PI）染色：冷卻后每個樣品加入PI至終濃度為50 μg/mL，在室溫中避光染色至少2 h。用300目（孔徑約40 flm-50 flm）尼龍網(wǎng)過濾后，即可上機測量。

1.2.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行分析。3次獨立實驗的數(shù)據(jù)采用Mean±SD表示，實驗組與對照組的組間差異比較采用t檢驗分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒質(zhì)粒鑒定 將質(zhì)粒用XbaI、NotI酶切。因插入片段的影響，重組質(zhì)粒與未重組質(zhì)粒約有50 bp的差異（圖1）。測序結(jié)果顯示質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖 1 重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果Fig 1 Double enzyme cutting result of recombinant plasmids. M: Marker； 1: pll3.7； 2: pll3.7-Control； 3: pll3.7-Survivin1； 4: pll3.7-Survivin2.

2.2 滴度測定 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞，48 h后熒光顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)染效率＞90%（圖2A）。Hela細胞感染慢病毒后在1×10-1、1×10-2、1×10-3中觀察到有綠色熒光，慢病毒的滴度約為108pfu/mL。圖2B為1×10-2稀釋度感染Hela細胞的效果。

圖 2 轉(zhuǎn)染效率及病毒滴度檢測結(jié)果。A：熒光檢測轉(zhuǎn)染的293T細胞（左）和明場觀察（右）；B：熒光檢測感染Hela細胞（左）和明場觀察（右）。Fig 2 Results of transfection efficiency and virus titer. A: 293T cell shot by fluorescent light (left) and light (right)； B: Hela cell shot by fluorescent light (left) and light (right).

2.3 干擾效果測定 RT-PCR結(jié)果顯示shRNA組中pLL3.7-Survivin2基因含量明顯降低（圖3A），說明在慢病毒的介導下，shRNA使A549細胞中Survivin mRNA的表達量明顯減少。同樣Western blot的結(jié)果也證實了Survivin蛋白減少的現(xiàn)象（圖3B）。

圖 3 RT-PCR及Western blot檢測結(jié)果。A：RT-PCR檢測Survivin mRNA的表達，柱狀圖為相對內(nèi)參GAPDH的灰度值；與Control組相比，*P＜0.05。B：Western blot檢測Survivin表達量。與Control相比，*P＜0.05。Fig 3 Results of RT-PCR (A) and Western blot (B). A: The result of Survivin mRNA RT-PCR, anlysis of expression compare with GAPDH；*P＜0.05, vs Control. B: The result of Survivin expression by Western blot. 1: PBS； 2: pLL3.7-Control； 3: pLL3.7-Survivin1； 4: pLL3.7-Survivin2.

2.4 Survivin shRNA對A549細胞增殖的影響 A549細胞感染慢病毒不同時間之后，MTT法檢測細胞增殖。表1顯示Survivin shRNA對細胞的增殖均起到了一定程度的抑制，且抑制率具有時間依賴性。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示感染pLL3.7-Survivin后處于G2-M期的細胞明顯增多，但并沒有明顯的凋亡峰出現(xiàn)（圖4）。

表 1 pLL3.7-Survivin對細胞增殖的抑制作用Tab 1 Inhibitory effect of pLL3.7-Survivin on cell proliferation

圖 4 流式細胞術(shù)檢測細胞周期。Fig 4 Results of flow cytometry. A:PBS； B: pLL3.7-Control； C: pLL3.7-Suivivin2； D: results of cell cycle.

3 討論

Survivin大小為16.5 kDa，在體內(nèi)以二聚體形式存在，是凋亡抑制蛋白家族成員。其主要在細胞周期的G2/M期表達。Survivin與活化的caspase3和caspase7結(jié)合，使caspase聚合體分離從而抑制其活性，進而保護了細胞周期調(diào)節(jié)因子如p21，從而抑制細胞凋亡[4]。Survivin可使p21與Cdk4解離，導致Cdk4活化，細胞進入增殖周期進而大量細胞無限生長，從而有利于腫瘤的發(fā)生[5]。Suvivin在細胞分裂中起重要作用，它的表達與細胞的周期變化相協(xié)調(diào)[6,7]。Survivin在G1期開始表達增加，G2/M期達到峰值。有絲分裂期間Survivin作為染色體乘客復合體的一部分發(fā)揮動粒微管的調(diào)節(jié)作用。Survivin在有絲分裂中期和后期作用于中心體和紡錘體維持穩(wěn)定性，確保姐妹染色體單體的準確分離。如果從系統(tǒng)中去除Survivin，動粒微管系統(tǒng)不能正確形成，從而細胞停止分裂，最終導致細胞死亡。在細胞分裂期間Survivin也結(jié)合到有絲分裂器的微管，通過與周期依賴蛋白激酶1（cyclin-dependent protein kinase 1, CDK1）作用，Survivin的Thr34發(fā)生磷酸化，從而穩(wěn)定蛋白并抑制分裂細胞的凋亡[7,8]。Survivin在正常成年分化組織中不表達或低表達，而在人類惡性腫瘤組織中表達極高[9-11]，故針對Survivin的基因治療具有很好的靶向性、特異性和安全性[12]。

近幾年來，慢病毒載體因其獨特的優(yōu)勢，逐漸成為表達載體中的熱點。慢病毒通常是由HIV去除env、vif、vpr、vpu、nef等毒性基因改造而來。復制缺陷型載體由VSVG代替HIV的包膜進行包裝，具有單復制周期、安全、宿主范圍廣的優(yōu)點[13]。

本實驗通過設(shè)計Survivin干擾靶序列，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并將pLL3.7-Survivin轉(zhuǎn)染293T細胞后利用Hela細胞檢測病毒的滴度并感染A549細胞，RT-PCR和Western blot檢測干擾效果明顯；MTT與流式細胞術(shù)分析顯示細胞受阻于G2/M期。這為研究RNAi介導的肺癌基因治療打下了基礎(chǔ)。