許崇安 王小杰 張曄 李琳

鉑類藥物（順鉑或卡鉑）是治療非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的重要藥物，其與長春瑞濱、吉西他濱、紫杉醇、多西他賽任一聯(lián)合的兩藥方案對NSCLC患者化療的有效率相似[1]，與非鉑類方案相比，含鉑兩藥方案化療能夠延長NSCLC患者的生存期，并提高其生活質(zhì)量[2]，含鉑兩藥方案現(xiàn)已成為治療進(jìn)展期NSCLC的標(biāo)準(zhǔn)一線方案。鉑類藥物主要通過損傷DNA而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[3]，而機體的DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)可以修復(fù)這類損傷，從而影響鉑類藥物化療的敏感性。由于個體之間對DNA損傷后的修復(fù)能力有很大的差異[4,5]，因此，常可導(dǎo)致即使同樣是NSCLC，甚至是病理類型和臨床分期相同的患者采用相同的治療方案，其治療效果和不良反應(yīng)卻明顯不同。DNA修復(fù)基因的過表達(dá)及DNA修復(fù)基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）可改變DNA修復(fù)能力，因此，檢測DNA修復(fù)基因的SNP可以預(yù)測個體腫瘤化療的敏感性和預(yù)后。

X線修復(fù)交錯互補基因1（X-ray repair cross complementing gene 1, XRCC1）是DNA堿基切除修復(fù)和單鏈斷裂修復(fù)系統(tǒng)中的重要成分，參與鉑類藥物等引起的DNA修復(fù)過程，該基因編碼區(qū)存在導(dǎo)致氨基酸取代的SNP，這些SNP影響XRCC1的活性[6,7]。雖然許多功能性研究已報告了XRCC1對腫瘤的影響，但其SNP與NSCLC鉑類藥物化療敏感性關(guān)聯(lián)的研究結(jié)果卻不盡相同。X線修復(fù)交錯互補基因3（X-ray repair cross complementing gene 3, XRCC3）是Rad51 DNA修復(fù)基因家族成員，雖然在DNA雙鏈斷裂同源性重組修復(fù)中扮演重要角色[8]，但其Thr241Met位點的SNP與鉑類藥物化療敏感性的關(guān)系尚不清楚。本研究報告130例晚期NSCLC患者XRCC1和XRCC3的SNP以及它們與鉑類藥物化療療效的關(guān)系，為個體化化療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 2008年8月-2010年3月中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院收治的經(jīng)病理證實的初治晚期NSCLC患者130例，其中男性90例，女性40例，均為漢族；中位年齡62（28-83）歲；吸煙80例，不吸煙50例；腺癌76例，鱗癌46例，其它類型8例；臨床分期：IIIb期58例，IV期72例；ECOG PS評分：0分44例，1分86例。所有患者均有可測量病灶并均接受了2個-6個周期（平均4個周期）含鉑兩藥方案化療。具體化療方案如下：長春瑞濱+鉑類（順鉑或卡鉑）82例，吉西他濱+鉑類26例，紫杉醇類（紫杉醇或多西他賽）+鉑類22例。

1.2 樣本收集 血液標(biāo)本在患者知情同意的情況下，于化療前抽取靜脈血5 mL，靜置后取血凝塊并提取DNA，將提取的DNA置于-20oC低溫冰箱中備用。

1.3 療效評定 所有患者均經(jīng)含鉑兩藥方案化療2個周期后根據(jù)RECIST標(biāo)準(zhǔn)評定療效，分為完全緩解（complete response, CR）、部分緩解（partial response, PR）、疾病穩(wěn)定（stable disease, SD）和疾病進(jìn)展（progressive disease,PD）?？陀^緩解=CR+PR，未緩解=SD+PD。

1.4 基因型分析 采用PCR-RFLP方法進(jìn)行XRCC1、XRCC3基因型檢測。引物序列及擴(kuò)增片段大小見表1。25 μL PCR反應(yīng)混合液中含1 μL DNA、0.4 μmol/L引物各1 μL、0.1 mmol/L dNTP 2 μL、Taq聚合酶0.125 U、5×反應(yīng)緩沖液5 μL。PCR反應(yīng)條件: 95oC預(yù)變性5 min；95oC 45 s，61oC 45 s，72oC 45 s，35個循環(huán)；72oC延伸10 min。分別取5 μL PCR產(chǎn)物與相應(yīng)的核酸內(nèi)切酶37oC溫育過夜，XRCC1 Arg194 Trp、Arg399 Gln及XRCC3 Thr241 Met核酸內(nèi)切酶分別為PvuII、NciI和NlaIII。3.0%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物。隨機抽取30%樣本，雙盲法重復(fù)檢測加以驗證，結(jié)果完全一致。

1.5 統(tǒng)計分析 應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用χ2檢驗或Fisher's精確概率法比較不同基因型之間化療療效的差異，采用非條件Logistic回歸分析計算優(yōu)勢比（odds ratio,OR）及其95%可信區(qū)間（confidence interval, CI）評價不同基因型及多態(tài)位點間聯(lián)合與療效的相關(guān)性。所有檢驗均為雙側(cè)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 療效分析 130例晚期NSCLC患者經(jīng)含鉑兩藥方案化療2個周期后，CR 0例，PR 44例（33.8%），SD 54例（41.6%），PD 32例（24.6%），化療總有效率為33.8%（44/130）。

2.2 基因分布 130例晚期NSCLC患者，在XRCC1 Arg-194Trp位點中，攜帶Arg/Arg、Arg/Trp和Trp/Trp基因型患者分別為54例（41.5%）、40例（30.8%）和36例（27.7%）。在XRCC1 Arg399 Gln位點中，攜帶Arg/Arg、Arg/Gln和Gln/Gln基因型患者分別為66例（50.8%）、54例（41.5%）和10例（7.7%）。在XRCC3 Thr241 Met位點中，攜帶Thr/Thr和Thr/Met基因型患者分別為114例（87.7%）和16例（12.3%），未檢測到Met/Met純合突變基因型。

2.3 基因型與化療療效的關(guān)系 從表2可見，攜帶XRCC1 194 Arg/Arg、Arg/Trp和Trp/Trp基因型NSCLC患者的化療有效率分別為22.2%、35.0%和50.0%，有明顯差異（χ2=7.478, P=0.024）。攜帶Trp/Trp基因型患者的化療有效率是Arg/Arg基因型攜帶者的3.5倍（P=0.006）。攜帶至少1個Trp等位基因（Arg/Trp和Trp/Trp基因型）患者的化療有效率至少是攜帶Arg/Arg基因型患者的2.5倍（P=0.018）。攜帶XRCC1 399 Arg/Arg、Arg/Gln和Gln/Gln基因型患者的化療有效率分別為45.5%、25.9%和0，攜帶XRCC1 399 Arg/Arg基因型患者的化療有效率明顯高于其它基因型攜帶者。攜帶XRCC3 241 Thr/Thr與Thr/Met基因型患者化療有效率分別為31.6%和50.0%，二者無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.145）。

年齡、性別、吸煙、病理類型及臨床分期與晚期NSCLC患者化療敏感性均無統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)（P＞0.05）。

2.4 XRCC1 Arg194 Trp和Arg399 Gln多態(tài)聯(lián)合作用與化療療效的關(guān)系 我們進(jìn)一步分析了XRCC1 Arg194 Trp和Arg399 Gln兩個位點基因型聯(lián)合與化療療效的關(guān)系，結(jié)果顯示，XRCC1 194和399多態(tài)之間在化療敏感性方面存在明顯相互作用，同時攜帶XRCC1 194Arg/Arg和399Gln/Gln基因型的10例患者無一例有效，而攜帶至少1個XRCC1 194 Trp等位基因同時又?jǐn)y帶XRCC1 399 Arg/Arg基因型者的化療有效率明顯高于同時攜帶194 Arg/Arg和399 Arg/Gln基因型者（表3）。

2.5 XRCC1與XRCC3聯(lián)合基因型與化療療效的關(guān)系 本研究進(jìn)一步分析了XRCC1與XRCC3兩個基因不同多態(tài)基因型聯(lián)合與化療敏感性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)XRCC1與XRCC3多態(tài)之間在化療敏感性方面存在明顯的相互作用；攜帶至少1個XRCC1 194 Trp等位基因和399 Arg/Arg野生型基因同時又?jǐn)y帶XRCC3 241 Thr/Met基因型者的化療有效率明顯高于其它基因型攜帶者（表4）。

3 討論

人類細(xì)胞中存在大量DNA修復(fù)基因，它們對某些類型的DNA損傷具有特異性修復(fù)能力，對避免基因突變、維護(hù)基因組的穩(wěn)定性和完整性具有重要的作用。許多DNA修復(fù)基因具有SNP，導(dǎo)致氨基酸替代的SNP可能改變修復(fù)酶的活性，并且可能是導(dǎo)致個體DNA損傷修復(fù)能力差異的重要原因[9]。研究[10]表明，DNA修復(fù)能力與腫瘤易感性密切相關(guān)，DNA修復(fù)能力低腫瘤易感性高；而在腫瘤治療過程中，DNA修復(fù)能力的增加卻阻礙了療效的發(fā)揮，腫瘤細(xì)胞的DNA修復(fù)能力與化療敏感性密切相關(guān)。

XRCC1的SNP可影響XRCC1蛋白的正常功能，從而影響DNA修復(fù)能力[11]。XRCC1 SNP與鉑類藥物化療敏感性相關(guān)，攜帶XRCC1 194 Trp等位基因的NSCLC患者對鉑類藥物化療敏感，而攜帶Arg/Arg基因型患者對鉑類藥物化療失敗的風(fēng)險幾乎是攜帶至少1個Trp等位基因患者的3倍。攜帶至少1個XRCC1 399 Gln等位基因的患者對鉑類藥物化療失敗的風(fēng)險是399 Arg/Arg攜帶者的2.7倍。而且XRCC1 194和399這兩個位點的SNP存在聯(lián)合作用，同時攜帶194 Arg/Trp和399 Arg/Arg基因型患者對鉑類藥物化療的敏感性更高[12]。洪成雨等[13]研究結(jié)果顯示，僅XRCC1 194基因多態(tài)與NSCLC患者鉑類藥物化療的敏感性相關(guān)，而Arg399 Gln基因多態(tài)與化療敏感性無關(guān)，而且XRCC1 194和399兩個位點的SNP也無聯(lián)合作用。姚成云[14]和趙萬[15]的研究雖然證實了XRCC1 399基因多態(tài)與NSCLC患者鉑類藥物化療敏感性相關(guān)，但其結(jié)果卻顯示，攜帶XRCC1 399 Gln突變基因患者的化療反應(yīng)率反而明顯高于399 Arg/Arg野生型基因攜帶者。

表 1 PCR引物及擴(kuò)增片段大小Tab 1 PCR primers and product sizes

表 2 XRCC1和XRCC3基因型與NSCLC化療敏感性的關(guān)系Tab 2 The relationship between XRCC1 and XRCC3 genotypes and chemosensitivity of NSCLC

表 3 XRCC1 Arg194 Trp和Arg399 Gln多態(tài)聯(lián)合與化療療效的關(guān)系Tab 3 Interaction of XRCC1 Arg194 Trp and XRCC1 Arg399 Gln polymorphisms on the chemotherapy response

表 4 XRCC1和XRCC3聯(lián)合基因型與化療療效的關(guān)系Tab 4 Associations of XRCC1 and XRCC3 genotypes with the efficacy of chemotherapy

本研究結(jié)果表明，XRCC1 Arg194 Trp和Arg399 Gln兩個位點的SNP均與NSCLC患者鉑類藥物的化療敏感性密切相關(guān)。攜帶XRCC1 194 Trp純合突變基因患者的化療有效率是Arg/Arg野生型基因攜帶者的3.5倍（P=0.006）。攜帶至少1個Trp等位基因患者的化療有效率至少是攜帶Arg/Arg基因型患者的2.5倍（P=0.018）。攜帶XRCC1 399 Arg/Arg野生型基因患者的化療有效率明顯高于其它基因型攜帶者。XRCC1 194和399兩個位點基因多態(tài)之間在化療敏感性方面存在明顯的相互作用，攜帶至少1個XRCC1 194 Trp等位基因同時又?jǐn)y帶XRCC1 399 Arg/Arg基因型患者的化療有效率明顯高于同時攜帶194 Arg/Arg和399 Arg/Gln基因型患者。本研究結(jié)果表明，攜帶XRCC1 194 Trp突變基因的患者對鉑類藥物化療敏感，同時攜帶XRCC1 194 Trp突變基因和399 Arg/Arg野生型基因的患者對鉑類藥物化療更敏感，而攜帶XRCC1 194 Arg/Arg野生型基因和399 Gln突變基因的患者對鉑類藥物化療耐藥。

許多研究報告了XRCC3 241 SNP與肺癌易感性的關(guān)聯(lián)，但其研究結(jié)果卻不盡相同，就目前的研究結(jié)果而言，尚無證據(jù)表明XRCC3 241多態(tài)性與中國人肺癌易感性相關(guān)[16,17]。而XRCC3 Thr241 Met的SNP與鉑類藥物化療敏感性關(guān)系的研究較少，國內(nèi)僅見任勝祥等[18]報告了ERCC1和XRCC3 241基因多態(tài)性在接受含鉑方案化療NSCLC中的療效預(yù)測作用，其結(jié)果顯示，130例晚期NSCLC患者中85.4%攜帶XRCC3 241 Thr/Thr基因型，16.4%攜帶Thr/Met或Met/Met基因型。XRCC3 241各基因型之間化療有效率無統(tǒng)計學(xué)差異。本研究結(jié)果顯示，在130例晚期NSCLC患者中，攜帶Thr/Thr和Thr/Met基因型患者分別為87.7%和12.3%，未檢測到Met/Met純合突變基因型。攜帶XRCC3 241 Thr/Thr和Thr/Met基因型者之間的化療有效率無統(tǒng)計學(xué)差異。但XRCC1和XRCC3多態(tài)在化療敏感性方面卻存在明顯的交互作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，XRCC1 194和399基因單核苷酸多態(tài)性均與晚期NSCLC患者鉑類藥物化療敏感性密切相關(guān)，而XRCC3 241單核苷酸多態(tài)性與鉑類藥物化療療效無關(guān)。不僅XRCC1 194和399兩個位點的基因多態(tài)具有聯(lián)合作用，而且XRCC1與XRCC3兩個基因多態(tài)在鉑類藥物化療敏感性方面亦存在明顯的交互作用。由此可見，XRCC1和XRCC3兩個基因的多態(tài)性可能對臨床化療藥物的選擇具有指導(dǎo)意義。但由于本研究樣本量較少，在應(yīng)用于臨床之前尚需擴(kuò)大樣本深入研究DNA堿基切除修復(fù)系統(tǒng)乃至整個DNA修復(fù)系統(tǒng)與鉑類藥物敏感性的關(guān)系，為腫瘤個體化治療提供理論依據(jù)。