宋希雙，楊德勇，汪淑晶，車翔宇，王建伯，葉林，王麗娜

（1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，遼寧 大連 116011；2.大連醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)教研室，遼寧 大連 116011；3.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科，上海 200032）

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤，手術(shù)治療后腫瘤容易復(fù)發(fā)。RNA干擾能夠特異性下調(diào)膀胱癌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的癌基因，為膀胱癌的基因治療提供有力的手段，具有十分重要的臨床應(yīng)用價值［1］。然而如何將治療性基因片段在患者體內(nèi)安全高效、特異的導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞是亟待解決的問題［2］。病毒載體雖然可以較好的完成這一任務(wù)，但其與人基因組整合后出現(xiàn)的致瘤性大大增加了基因治療的危險性，限制了其臨床應(yīng)用［3］。尋找更加有效的基因轉(zhuǎn)染方法成為許多基因治療的關(guān)鍵。

超聲輻照超聲微泡（microbubble destruction with ultrasound）是一種相對安全、高效的基因轉(zhuǎn)染方法，超聲波輻照超聲微泡破裂后對細(xì)胞產(chǎn)生的空化效應(yīng)可以使細(xì)胞膜的通透性可逆性增加，促進(jìn)基因向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染，具有安全、高效、靶向性強的特點，是一種十分有前途的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染方法［4］。在本實驗中，我們使用超聲微泡的方法向T24細(xì)胞中轉(zhuǎn)染熒光標(biāo)記的siRNA小片段，并通過MTT實驗和流式細(xì)胞儀評估其安全性和轉(zhuǎn)染效率，為尋找安全、特異、高效的體內(nèi)轉(zhuǎn)染方法提供體外實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及培養(yǎng)

人膀胱癌細(xì)胞系T24購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心。培養(yǎng)于含10%小牛血清，100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素組成的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2、、95%濕度的孵箱內(nèi)。

1.2 主要試劑

FITC標(biāo)記的陰性對照siRNA由上海吉瑪公司合成。超聲微泡造影劑由重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所提供（凍干粉劑型，經(jīng)第三軍醫(yī)大學(xué)鈷源輻照中心消毒處理），是內(nèi)含六氟化碳惰性氣體的脂質(zhì)類微泡。將約1 g超聲微泡干粉（白色粉末狀）溶解于2 mL PBS中形成白色乳狀溶液，顯微鏡下對微泡進(jìn)行計數(shù)，微泡濃度約為1×107/mL，微泡直徑大小約為2～10 μm。將該溶液置于4℃放置24 h，微泡濃度沒有明顯變化。超聲基因轉(zhuǎn)染治療儀：UGT 1025型，由重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所研制，頻率1 MHz，聲強在 0.4～4 W/cm2范圍內(nèi)可調(diào)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取生長狀態(tài)良好的T24細(xì)胞在24孔板中培養(yǎng)，細(xì)胞長至60%～80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將超聲微泡造影劑用無菌雙蒸水配制后，記數(shù)微泡濃度，按所需終濃度取出所需體積，同樣根據(jù)反義寡核苷酸所需終濃度從上述配好的原液中取出所需體積，將2者混合后，輕柔混勻，冰上靜置20 min，即可用于轉(zhuǎn)染。實驗分為4組：siRNA組（Blank），siRNA+超聲輻照組（U），siRNA+超聲微泡組（MB），siRNA+超聲微泡+超聲輻照組（U+MB）。超聲輻照參數(shù)設(shè)定在1.2 W，輻照時間30 s。超聲微泡濃度為（1×106/mL），siRNA濃度為30 nmol/L。繼續(xù)培養(yǎng)6 h后棄舊培養(yǎng)液同時加入正常培養(yǎng)液，置37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后使用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。

超聲輻照超聲微泡轉(zhuǎn)染組采用上述參數(shù)（1.2 W，輻照30 s），脂質(zhì)體使用Invitrogen公司的Lipofectamine 2000，siRNA濃度均為 30 nmol/L，轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞48 h后使用流式細(xì)胞儀檢測siRNA的轉(zhuǎn)染效率，使用MTT實驗檢測2種轉(zhuǎn)染方法對細(xì)胞活力的影響。

1.4 MTT實驗檢測細(xì)胞活力

設(shè)對照組，調(diào)零組和處理組，每組設(shè)5個復(fù)孔。用0.25%的胰酶消化細(xì)胞，離心吹打成單細(xì)胞懸液，以0.5×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL細(xì)胞懸液，而調(diào)零組只加等量培養(yǎng)液。細(xì)胞貼壁正常生長融合度為70%～90%時，對處理組予轉(zhuǎn)染處理。再將培養(yǎng)板置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，在每孔加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，加入DMSO 200 μL溶解紫色結(jié)晶體，適當(dāng)振搖20 min使其充分溶解，用自動酶標(biāo)儀測定490 nm波長的吸光度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。每一項分析至少有3次結(jié)果。數(shù)值用±s表示，采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 超聲微泡的穩(wěn)定性以及超聲輻照破碎微泡的效果

1 MHz，功率為1.2 W的超聲照射微泡10 s，20 s，30 s，40 s，50 s，60 s后，在顯微鏡下對微泡直接進(jìn)行計數(shù)。如圖1所示，在上述超聲參數(shù)條件下，當(dāng)照射時間大于30 s時，超聲微泡可以有效的使微泡發(fā)生破裂，與照射前比較照射后微泡濃度降低大于80%。

2.2 超聲輻照超聲微泡可以明顯提高siRNA轉(zhuǎn)染效率

使用熒光顯微鏡觀察siRNA的轉(zhuǎn)染效率，使用MTT實驗評估T24細(xì)胞的活力。如圖2A所示，與對照組［Blank：（2.12±1.02）%；U：（2.31±3.23）%；MB：（1.89±1.82）%］相比，超聲輻照超聲微泡顯著增加siRNA 的轉(zhuǎn)染效率［U+MB：（29.57±8.25）%］。MTT實驗結(jié)果表明，1.2 W強度超聲輻照超聲微泡30 s對T24細(xì)胞活性沒有顯著影響［U+MB：（96.44±8.75）%；Blank：（99.25±10.09）%；U：（98.34±9.11）%；MB：（99.71±9.63）%］（圖 2B）。

2.3 超聲輻照強度和輻照時間對轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞活力的影響

使用熒光顯微鏡觀察不同條件下siRNA轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞的效率，并使用MTT實驗檢測不同條件超聲輻照對T24細(xì)胞活性的影響。如圖3A所示，在超聲功率1.2 W時，轉(zhuǎn)染效率隨著輻照時間的增加而增加，但輻照時間超過30 s后轉(zhuǎn)染效率并沒有明顯增加。T24細(xì)胞的在輻照30 s以內(nèi)沒有明顯變化，但輻照時間超過30 s后細(xì)胞活力呈明顯下降趨勢（圖3B）。進(jìn)而我們選擇超聲輻照30 s，觀察不同超聲功率對siRNA轉(zhuǎn)染效率的影響。如圖3C所示，隨著超聲功率的增加siRNA轉(zhuǎn)染效率呈現(xiàn)增加的趨勢，當(dāng)輻照功率超過1.2 W后siRNA的轉(zhuǎn)染效率沒有明顯的增加。在超聲輻照強度在1.2 W以內(nèi)時T24細(xì)胞的活力沒有明顯的改變，當(dāng)輻照強度超過1.2 W時T24細(xì)胞的活力呈明顯下降趨勢（圖3D）。

2.4 超聲輻照超聲微泡與脂質(zhì)體體外轉(zhuǎn)染siRNA的比較

進(jìn)一步比較超聲微泡介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率與安全性。如圖4A所示，超聲輻照超聲微泡轉(zhuǎn)染組的轉(zhuǎn)染效率［U+MB：（26.86±6.03）%］明顯低于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組［Lipo：（92.34±10.77）%］，2 種方法的轉(zhuǎn)染效率均顯著高于空白對照。2種轉(zhuǎn)染方法對細(xì)胞活力的影響沒有顯著性差異［U+MB：（90.46±9.04）%；Lipo：（87.66±8.07）%］，（圖 4B）。

3 討論

使用分子生物學(xué)的方法對腫瘤進(jìn)行基因治療很可能成為臨床腫瘤治療的重要手段。安全、高效、特異的將治療性外源基因輸送到腫瘤靶細(xì)胞是各種腫瘤基因治療策略成功的關(guān)鍵［5］。病毒載體具有較高的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率，然而機體對病毒載體潛在的免疫性以及病毒載體整合人基因組后的致畸性和致瘤性等難以克服的障礙限制了其在臨床的應(yīng)用［6］。陽離子脂質(zhì)、脂質(zhì)體、高分子載體材料等非病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)染方法雖然具有制備簡易，無免疫原性，相對安全等優(yōu)點，但在體內(nèi)轉(zhuǎn)染的效率較低，靶向性差等問題仍有待進(jìn)一步解決［7］。超聲轉(zhuǎn)染是一種新型的轉(zhuǎn)染基因的方法，超聲輻照超聲微泡破裂后產(chǎn)生的機械效應(yīng)和空化效應(yīng)能夠可逆性的增加細(xì)胞膜通透性，促進(jìn)外源性基因片段進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)提高基因的轉(zhuǎn)染效率［8］。此外，超聲還可以實時監(jiān)控超聲微泡的分布，選擇性的照射腫瘤部位，提高基因轉(zhuǎn)染的靶向性。因此，超聲輻照超聲微泡的轉(zhuǎn)染方法很可能是一種安全、高效、特異的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染手段。

超聲微泡主要由外殼和內(nèi)部包含的氣體兩部分組成，較早使用的超聲微泡內(nèi)含空氣，目前常規(guī)使用的微泡內(nèi)含惰性氣體。以利聲顯為代表的第一代微泡聲學(xué)造影劑，其包裹空氣的殼厚，易破，諧振能力差，而且不夠穩(wěn)定。以聲諾維為代表的第二代微氣泡造影劑，其內(nèi)含高密度的惰性氣體六氟化锍，穩(wěn)定性好。微泡的外殼主要分為3類：白蛋白類，脂質(zhì)類，和高分子復(fù)合物類。相對于白蛋白外殼微泡，脂質(zhì)類微泡具有更好的穩(wěn)定性。在本實驗中我們使用的是由重慶醫(yī)科大學(xué)自制的內(nèi)含惰性氣體六氟化碳脂質(zhì)類微泡，具有穩(wěn)定性好，使用方便等特點。最近出現(xiàn)了高質(zhì)量的新型聲學(xué)造影劑，高安全性、低副作用，微泡大小均勻，直徑小于10 μm并能控制，可自由通過毛細(xì)血管，有類似紅細(xì)胞的血流動力學(xué)特征，穩(wěn)定性好。然而這些商品化的超聲微泡目前主要用于臨床超聲影響學(xué)診斷，用于介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染還有待于進(jìn)一步實驗評估。

在本研究中，我們比較了單獨使用超聲照射、單獨使用超聲微泡造影劑以及超聲微泡照射超聲造影劑對siRNA轉(zhuǎn)染效率的影響。單獨使用超聲照射或單獨使用超聲微泡幾乎沒有任何促進(jìn)siRNA轉(zhuǎn)染的效果，說明超聲轉(zhuǎn)染有賴于超聲照射超聲微泡的緊密結(jié)合，然而其具體的促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染的機制仍然不清楚。較為可靠的機理可能是當(dāng)超聲照射超聲微泡，微泡發(fā)生破裂后產(chǎn)生的機械效應(yīng)和空化效應(yīng)可以使細(xì)胞膜的通透性短時間內(nèi)可逆性的增加，因此促進(jìn)了外源性基因向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移［9］。Taniyama使用電鏡掃描超聲轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞形態(tài)，證明細(xì)胞膜中出現(xiàn)較小的孔狀結(jié)構(gòu)，提示超聲轉(zhuǎn)染的重要機制之一是增加了細(xì)胞膜的通透性。Ran等體外培養(yǎng)大鼠肺動脈血管平滑肌細(xì)胞，加入造影劑后用超聲輻照20 s，電鏡觀察證實平滑肌細(xì)胞及細(xì)胞膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)可見明顯異常改變，細(xì)胞膜表面可見大小不等，數(shù)量不一的小孔，呈“彈坑”樣或“火山口”樣，實驗結(jié)束后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，這些特殊變化消失，證明出現(xiàn)的小孔是可逆的［10］。超聲微泡破裂后對細(xì)胞引起的其他生物學(xué)效應(yīng)仍知之甚少，進(jìn)一步了解探明其發(fā)生作用的機制對改善超聲微泡促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染的效率具有重要意義。

在本實驗中，我們進(jìn)一步比較了超聲微泡與脂質(zhì)體基因轉(zhuǎn)染效率以及對T24細(xì)胞活力的影響。超聲微泡介導(dǎo)的基因體外轉(zhuǎn)染效率仍明顯低于脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體目前體是體外基因轉(zhuǎn)染最為常用的方法，具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性低、使用方便、操作流程成熟等特點［11］。對于多數(shù)細(xì)胞而言，超聲輻照超聲微泡的體外轉(zhuǎn)染效率大多不超過40%［12～14］，超聲微泡促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染作為一種新的轉(zhuǎn)染手段仍有許多問題需要進(jìn)一步解決。首先，目前尚沒有專門用于基因轉(zhuǎn)染的商品化微泡轉(zhuǎn)染試劑，商品化的微泡造影劑多為臨床超聲影像學(xué)診斷使用，而這些試劑用于基因轉(zhuǎn)染是否需要進(jìn)一步加工處理，改變、改良某些與基因轉(zhuǎn)染相關(guān)的特性仍未有相關(guān)研究。其次超聲微泡促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染過程，具體參數(shù)缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的流程，目前對于超聲微泡促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染尚處于研究階段，這種轉(zhuǎn)染方法還沒有成為基因轉(zhuǎn)染的常規(guī)手段，各種研究所報告的轉(zhuǎn)染方法以及參數(shù)有較大差別，這可能與所使用超聲微泡的特性，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的種類，超聲輻照的方法等多種因素有關(guān)。然而超聲微泡促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染已經(jīng)初步顯示出其良好的臨床應(yīng)用價值，已有體內(nèi)實驗證明它是一種有效的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染方法，隨著超聲微泡促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染具體機制研究的不斷深入以及轉(zhuǎn)染方法的不斷改進(jìn)，超聲微泡基因轉(zhuǎn)染技術(shù)很可能成為有力的基因轉(zhuǎn)染方法。

［1］Oh YK，Park TG.siRNA delivery systems for cancer treatment［J］.Adv Drug Deliv Rev，2009，61（10）：850-862.

［2］Li L.，Shen Y.Overcoming obstacles to develop effective and safe siRNA therapeutics［J］.Expert Opin Biol Ther，2009，9 （5）：609-619.

［3］Sharma A，Tandon M，Bangari DS，et al.Adenoviral vector-based strategies for cancer therapy［J］.Curr Drug ther，2009，4（2）：117-138.

［4］Feril LB Jr.Ultrasound-mediated gene transfection［J］.MethodsMol Biol，2009，542：179-194.

［5］Wang SL，Yao HH，Qin ZH.Strategies for short hairpin RNA delivery in cancer gene therapy ［J］.Expert Opin Biol Ther，2009，9（11）：1357-1368.

［6］Sharma A，Tandon M，Bangari DS，et al.Adenoviral vector-based strategies for cancer therapy［J］.Curr Drug ther，2009，4（2）：117-138.

［7］Al-Dosari M S，Gao X.Nonviral gene delivery：principle，limitations，and recent progress［J］.AAPS J，2009，11（4）：671-681.

［8］Yoon C S，Park JH.Ultrasound-mediated gene delivery ［J］.Expert Opin Drug Deliv，2010，7（3）：321-330.

［9］Reslan L，Mestas JL，Herveau S，et al.Transfection of cells in suspension by ultrasound cavitation ［J］.J Con Relea，2010，142（2）：251-258.

［10］Wang ZG，Ling ZY，Ran HT.Experimental study on ultrasoundmediated microbubble destruction deliver VEGF gene to myocardium of rats and its bioloyical effects ［J］.Chi J Med Imag Tech，2004，19（6）：656-658.

［11］Schwendener RA.Liposomes in biology and medicine［J］.Adv Exp Med Biol，2007，620 ：117-128.

［12］Mehier-Humbert S，Bettinger T，Yan F，et al.Influence of polymer adjuvants on the ultrasound-mediated transfection of cells in culture［J］.Eur J Pharm Biopharm，2009，72（3）：567-573.

［13］Li Y S，Davidson E，Reid CN，et al.Optimising ultrasound-mediated gene transfer（sonoporation）in vitro and prolonged expression of a transgene in vivo：potential applications for gene therapy of cancer［J］.Cancer Lett，2009，273（1）：62-69.

［14］Duvshani-Eshet M，Baruch L，Kesselman E，et al.Therapeutic ultrasound-mediated DNA to cell and nucleus：bioeffects revealed by confocal and atomic force microscopy ［J］.Gene Ther，2006，13（2）：163-172.