姜華茂，傅德望，司淑斌，宋斌，張春陽(yáng)

（遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院泌尿外科，遼寧 錦州 121001）

膀胱癌行經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)后仍有較高的復(fù)發(fā)率和進(jìn)展率［1］。單純經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)不能解決術(shù)后高復(fù)發(fā)和進(jìn)展問題，膀胱灌注是膀胱癌術(shù)后治療的重要方面［2］。多藥耐藥發(fā)生是膀胱腔內(nèi)化療失敗的重要原因，而聯(lián)合其他藥物是減少多藥耐藥、增強(qiáng)膀胱灌注療效的重要方法。吡柔比星和干擾素α-2b膀胱灌注對(duì)經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)后都有一定療效［3～5］。本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察吡柔比星聯(lián)合干擾素α-2b膀胱灌注對(duì)大鼠膀胱癌的作用，并初步探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組：雌性Wistar大鼠80只，10～12 周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、吡柔比星組、干擾素組和聯(lián)合用藥組，每組20只。

1.1.2 主要試劑與設(shè)備：N-甲基-N-亞硝基脲（N-methyl-N-nitrosourea，MNU，Sigma公司），以 pH6.0的枸櫞酸緩沖液配成濃度為20 mg/mL的溶液；鹽酸吡柔比星（深圳萬(wàn)樂藥業(yè)有限公司），以注射用水配制成1.0 mg/mL吡柔比星溶液；注射用重組干擾素α-2b（安徽安科生物工程集團(tuán)股份有限公司），以注射用水配制成濃度為30萬(wàn)IU/mL溶液；聯(lián)合用藥組中吡柔比星和重組干擾素α-2b濃度與各單一用藥組一致。兔抗大鼠CD34抗體（武漢博士德生物公司）；SABC免疫組化染色試劑盒（武漢博士德生物公司）；DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物公司）；CD34兔抗大鼠單克隆抗體試劑盒（Santa Cruz公司）；Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（北京寶賽生物技術(shù)有限公司）。BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson公司）；Autostainer plus全自動(dòng)免疫組化染色儀（丹麥DAKO公司）；CIAS-1000型細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)（北京大恒圖像視覺有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 膀胱癌模型制作和用藥：MNU溶液0.2 mL每周1次膀胱灌注，誘導(dǎo)大鼠膀胱癌。對(duì)照組、吡柔比星組、干擾素組和聯(lián)合用藥組大鼠于首次灌注MNU后第8周，分別行生理鹽水0.5 mL、吡柔比星溶液0.5 mL、重組干擾素α-2b溶液0.5 mL和吡柔比星+重組干擾素α-2b溶液0.5 mL膀胱灌注，每周1次，共6次。

1.2.2 病理觀察：灌注MNU后第8周，每組隨機(jī)抽取2只大鼠，處死后解剖膀胱，觀察膀胱內(nèi)情況后常規(guī)制作光鏡切片，HE染色，病理觀察。第14周處死其余大鼠，切取膀胱，稱膀胱質(zhì)量。選取一塊最大膀胱腫瘤制作石蠟標(biāo)本塊，切片，HE染色，進(jìn)行病理觀察。

1.2.3 免疫組化檢測(cè)：石蠟標(biāo)本塊切片，厚4 μm，免疫組織化學(xué)方法以CD34標(biāo)記微血管。在不知實(shí)驗(yàn)和病理特征的單盲情況下，由專業(yè)病理人員先在40倍和100倍鏡下掃視整個(gè)切片，尋找新生血管熱點(diǎn)區(qū)，400倍鏡下計(jì)數(shù)染成棕黃色的血管數(shù)目，以5個(gè)視野下血管數(shù)目的平均值表示微血管密度（microvessel densitiy，MVD）。被CD34染成棕黃色的血管內(nèi)皮，若與鄰近微血管、腫瘤細(xì)胞或其他結(jié)締組織分開即視為一個(gè)微血管，只要結(jié)構(gòu)不相連其分支結(jié)構(gòu)也作為一個(gè)血管。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)：切取各組病理取材后的腫瘤組織，PBS漂洗，用眼科剪反復(fù)剪碎組織，200目不銹鋼篩研磨過濾，并不斷以PBS沖洗，吸取濾過的單細(xì)胞懸液置離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，以Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠存活情況和一般狀態(tài)觀察

大鼠在膀胱灌注后2.0～2.5 h排尿，3.0～4.0 h后恢復(fù)活動(dòng)，誘癌期間各組大鼠毛色、食量、營(yíng)養(yǎng)狀況及體質(zhì)量等一般情況無(wú)明顯差別。實(shí)驗(yàn)過程中共有63只大鼠存活，其中對(duì)照組17只、吡柔比星組16只、干擾素組14只、聯(lián)合用藥組16只。

2.2 病理學(xué)觀察

第8周時(shí)，可見膀胱內(nèi)微小結(jié)節(jié)和突起；光鏡下移行上皮細(xì)胞層數(shù)增多，排列紊亂，核染色質(zhì)為顆粒狀，分布不均勻，可見核分裂像，為不典型增生和移行細(xì)胞Ⅰ級(jí)（圖1A）。第14周時(shí)，各組大鼠膀胱均可見菜花狀、多發(fā)、大小不一的腫物；光鏡下膀胱黏膜細(xì)胞大小不一，細(xì)胞層數(shù)明顯增多，排列非常紊亂，極向消失，核大不規(guī)則，核膜增厚，核仁肥大，核質(zhì)比例增大，核分裂像明顯，可見不同級(jí)別的腫瘤組織，并侵入肌層（圖1B）。

2.3 各組大鼠膀胱的質(zhì)量

吡柔比星組和聯(lián)合用藥組大鼠膀胱質(zhì)量小于對(duì)照組（P<0.01），聯(lián)合用藥組大鼠膀胱質(zhì)量小于吡柔比星組（P<0.05），干擾素組大鼠膀胱質(zhì)量與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

2.4 各組的MVD

3個(gè)實(shí)驗(yàn)組大鼠膀胱腫瘤的MVD均小于對(duì)照組（P<0.01）。聯(lián)合用藥組MVD小于干擾素組（P<0.01），而與吡柔比星組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05），見圖2、表1。

表1 各組大鼠膀胱的質(zhì)量、M VD和AI（±s）Tab.1 The w ei ght s ofbl adders，M VD and AIofal lrat s（±s）Group n Weight of bladder（mg） MVD AI（%）Control 15 294.0±9.9 28.5±5.6 6.56±2.35 Pirarubicin 14 274.4±13.22） 9.8±3.12） 13.16±5.772）Interferon 12 295.3±8.2 21.1± 4.42） 11.5±4.01）Combination 14 265.7±11.72），3），5） 8.5±2.12），5） 22.7±8.22），4），5）1）P ＜ 0.05，2）P ＜ 0.01 vs control group；3）P ＜ 0.05，4）P ＜ 0.01 vs pirarubicin group；5）P ＜ 0.05 vs interferon group.

2.5 各組的AI

聯(lián)合用藥組大鼠的AI值高于其他3組（P<0.01），吡柔比星組和干擾素組的AI大于對(duì)照組（P分別<0.01和 0.05），見表1。

3 討論

用MNU誘癌法建立膀胱原位癌模型具有誘癌周期相對(duì)短、膀胱選擇性強(qiáng)、誘癌率高等優(yōu)點(diǎn)，MNU誘發(fā)的膀胱腫瘤與人類膀胱癌的組織學(xué)和生物學(xué)行為類似，適用于對(duì)藥物治療效果的評(píng)價(jià)［6］。本實(shí)驗(yàn)中各組大鼠均誘癌成功，死亡17只（17/80），在第1次誘導(dǎo)后第8周大鼠膀胱黏膜出現(xiàn)早期腫瘤表現(xiàn)，而在第14周膀胱腫瘤已呈多方和肌層浸潤(rùn)性改變。由于腫瘤的生長(zhǎng)，大鼠膀胱質(zhì)量增加，其中對(duì)照組膀胱質(zhì)量較大，而吡柔比星組和聯(lián)合用藥組膀胱質(zhì)量較?。≒<0.01），表明膀胱腫瘤的生長(zhǎng)受到抑制。干擾素組的MVD低于對(duì)照組且AI高于對(duì)照組，表明干擾素可抑制腫瘤生長(zhǎng)和促進(jìn)凋亡，但干擾素組膀胱質(zhì)量與對(duì)照組相近（295.3和294.0 mg），可能與干擾素膀胱灌注導(dǎo)致膀胱炎性改變有關(guān)。

吡柔比星是一種半合成的蒽環(huán)類抗癌藥，它能迅速進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，在S期通過直接嵌入DNA核酸堿基對(duì)間，干擾轉(zhuǎn)錄過程，終止細(xì)胞周期，使腫瘤細(xì)胞凋亡，故具有較強(qiáng)的抗癌活性。有研究表明，吡柔比星膀胱內(nèi)灌注后膀胱癌組織有較高濃度聚集，而正常膀胱組織黏膜層只有少量吡柔比星，并且膀胱腫瘤細(xì)胞的AI顯著高于對(duì)照組［7］。本研究也證實(shí)了吡柔比星促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞凋亡的作用，并且吡柔比星膀胱灌注后膀胱腫瘤的MVD也明顯降低，這表明吡柔比星膀胱灌注抑制膀胱腫瘤生長(zhǎng)的機(jī)制可能與抑制腫瘤血管生成有關(guān)。

重組干擾素α-2b具有廣譜抗病毒、抗腫瘤、抑制細(xì)胞增殖以及提高免疫功能等作用。單獨(dú)應(yīng)用干擾素α-2b治療膀胱腫瘤效果不佳，但與卡介苗等聯(lián)合應(yīng)用可取得較好的療效［3，4］。干擾素α-2b治療膀胱腫瘤與其增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞人類主要組織相容性復(fù)合體的表達(dá)、使腫瘤抗原能呈遞給T細(xì)胞并激活T細(xì)胞有關(guān)。干擾素α-2b可以降低腫瘤的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)，減少腫瘤的新生血管形成［8］。干擾素α-2b可使Fas配體表達(dá)增加，通過Fas/FasL途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［9］。本研究中，干擾素組大鼠膀胱腫瘤的MVD和AI均小于對(duì)照組，表明干擾素α-2b可抑制腫瘤微血管生長(zhǎng)和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

吡柔比星和干擾素分別從不同的機(jī)制干預(yù)大鼠膀胱腫瘤的生長(zhǎng)，聯(lián)合應(yīng)用吡柔比星和干擾素后膀胱腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制，膀胱質(zhì)量顯著降低，并且MVD較單用干擾素組明顯降低，AI也顯著高于單一用藥組，這可能與吡柔比星和干擾素聯(lián)合應(yīng)用后起到協(xié)同作用有關(guān)。Duchek等［10］對(duì)250例膀胱癌患者分別應(yīng)用卡介苗和表柔比星+干擾素術(shù)后灌注，結(jié)果顯示卡介苗組優(yōu)于表柔比星+干擾素聯(lián)合用藥組，但干擾素能夠與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用提高預(yù)防膀胱癌復(fù)發(fā)的療效是肯定的。另外卡介苗膀胱灌注的不良反應(yīng)也限制了其應(yīng)用。本研究對(duì)聯(lián)合應(yīng)用吡柔比星和干擾素抑制大鼠膀胱癌生長(zhǎng)進(jìn)行了初步的觀察，并就抑制微血管生長(zhǎng)和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)行了初步探討，但仍需進(jìn)一步深入研究，尤其是對(duì)機(jī)體和膀胱局部的免疫反應(yīng)進(jìn)行研究。

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