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        吡柔比星脂質(zhì)體制備與表征及其體外抗腫瘤作用

        2016-10-26 02:29:58王學(xué)菊程少會(huì)高立明付占昭徐紅梅王麗萍
        中國(guó)老年學(xué)雜志 2016年17期
        關(guān)鍵詞:吡柔比星脂質(zhì)體水化

        王學(xué)菊 程少會(huì) 高立明 鄭 磊 邸 婭 付占昭 姜 麗 徐紅梅 王麗萍

        (吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院病理科,吉林 長(zhǎng)春 130033)

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        吡柔比星脂質(zhì)體制備與表征及其體外抗腫瘤作用

        王學(xué)菊程少會(huì)1高立明1鄭磊1邸婭1付占昭1姜麗1徐紅梅1王麗萍

        (吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院病理科,吉林長(zhǎng)春130033)

        目的構(gòu)建吡柔比星脂質(zhì)體,提高吡柔比星的生物利用度和抑瘤作用,降低其毒副作用。方法采用薄膜水化法制備吡柔比星脂質(zhì)體,并測(cè)定其包封率和物理性狀。構(gòu)建乳腺癌細(xì)胞U14的荷瘤裸鼠模型,分別尾靜脈注射吡柔比星裸藥及吡柔比星脂質(zhì)體,分析其抑瘤作用。結(jié)果薄膜水化法制備的吡柔比星脂質(zhì)體平均粒徑(140.9±2.36)nm,多分散系數(shù)為(0.203±0.01),Zeta電位為-(14.2±2.64)mV,包封率為(75.1±3.5)%,并且可以緩釋吡柔比星;吡柔比星脂質(zhì)體組抑瘤率(75.1±8.6)%高于吡柔比星裸藥組(64.9±12.2)%。結(jié)論吡柔比星脂質(zhì)體是很有潛力的抗腫瘤納米藥物。

        吡柔比星;脂質(zhì)體;包封率;薄膜水化法;抑瘤率

        脂質(zhì)體作為藥物載體,具有靶向性、降低藥物毒性、減少藥物劑量等優(yōu)點(diǎn),因此脂質(zhì)體作為藥物載體被重視并得到了廣泛應(yīng)用〔1~3〕。脂質(zhì)體作為抗癌藥物載體能增加與癌細(xì)胞的親和力,且能夠增加藥物被癌細(xì)胞的攝取量,克服耐藥性,降低用藥量,提高療效,降低毒副作用。由于脂質(zhì)體的功能不同,脂質(zhì)體可分為傳統(tǒng)脂質(zhì)體、隱身脂質(zhì)體、長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體,免疫脂質(zhì)體等〔4〕。目前制備脂質(zhì)體常規(guī)的方法有薄膜分散法、逆向蒸發(fā)法、表面活性劑除去法、乙醇注入法、乳化法以及pH梯度法、硫酸銨梯度法等〔5〕。吡柔比星主要用于治療的惡性腫瘤包括白血病、乳腺癌、子宮癌、卵巢癌和肺癌等〔6〕。吡柔比星為紅色無(wú)臭粉末,其油水分配系數(shù)Log P為4.102(參考值),脂溶性好,能溶于乙醇和甲醇等溶劑,但其有累積性心臟毒性〔7〕、骨髓抑制、嚴(yán)重胃腸道反應(yīng)毒副作用〔8〕。本文采用薄膜水化法制備吡柔比星脂質(zhì)體,降低吡柔比星的毒副作用并提高通過(guò)其生物利用度,測(cè)定吡柔比星脂質(zhì)體的粒徑、多分散系數(shù)、Zeta電位、包封率、釋放曲線,構(gòu)建乳腺癌細(xì)胞U14的荷瘤裸鼠模型,研究吡柔比星脂質(zhì)體對(duì)實(shí)體瘤的腫瘤抑制率。

        1 材料與方法

        1.1材料及儀器吡柔比星(Sigma-Aldrich試劑公司),大豆卵磷脂、膽固醇(上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司),二氯甲烷、甲醇(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)。

        恒溫水浴鍋(杭州迅數(shù)科技有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器有限公司)、透射電鏡(JEOL JEM-1230)、超聲波清洗儀(日本島津)、紫外-可見(jiàn)吸收光譜儀(Agilent 8453)、馬爾文粒度分析儀(ZEN3600,Malvern Instruments Ltd,UK)。昆明小鼠50只,SPF級(jí),均為雌性,體重(18±2)g。U14宮頸癌細(xì)胞株(北京聯(lián)合利華生物技術(shù)有限公司)。

        1.2吡柔比星脂質(zhì)體的制備將一定量的大豆卵磷脂、吡柔比星和膽固醇溶于6 ml的甲醇-氯仿溶液中(氯仿與甲醇的體積比為2∶1)。在40℃,抽真空下除去有機(jī)溶劑,通氮?dú)? min以除去殘留的有機(jī)溶劑.將10 ml磷酸緩沖液(pH7.4)加入茄型瓶中水化15 min,超聲15 min,經(jīng)0.45 μm和0.22 μm濾膜過(guò)濾制得吡柔比星脂質(zhì)體。

        1.3吡柔比星脂質(zhì)體的形態(tài)通過(guò)透射電子顯微鏡觀察脂質(zhì)體形貌。將一滴脂質(zhì)體滴加到銅網(wǎng)上,2 min后使用濾紙將銅網(wǎng)表面液體小心吸走。待銅網(wǎng)風(fēng)干后使用2%的鉬酸銨對(duì)其進(jìn)行負(fù)染并在風(fēng)干后在透射電鏡下觀察。

        1.4吡柔比星脂質(zhì)體粒徑測(cè)定、多分散系數(shù)和Zeta電位測(cè)定取脂質(zhì)體少量,適量蒸餾水稀釋后,激光粒度分析儀測(cè)定吡柔比星脂質(zhì)體的平均粒徑及粒度分布、多分散系數(shù)和Zeta電位。

        1.5吡柔比星脂質(zhì)體包封率的測(cè)定采用超濾離心法測(cè)定吡柔比星脂質(zhì)體的包封率。取吡柔比星脂質(zhì)體2 ml,4 000 r/min離心30 min,收集下清液,紫外分光光度計(jì)分析下清液中吡柔比星含量(M游離)。脂質(zhì)體溶液中吡柔比星總質(zhì)量M總計(jì)算包封率:EE=(M總-M游離)/M總×100%。

        1.6吡柔比星脂質(zhì)體釋放曲線的測(cè)定取2 ml吡柔比星脂質(zhì)體置入透析袋中,放入50 ml一次性離心管中;加入釋放介質(zhì)(PBS,pH7.4)30 ml,于37℃、110 r/min恒溫振蕩。分別于0.25、0.5、1、2、4、6、8、16、24和40 h取樣2 ml(同時(shí)補(bǔ)充等溫等量釋放介質(zhì)),用紫外分光光度計(jì)于495 nm測(cè)定波長(zhǎng)處測(cè)定吡柔比星的含量。

        1.7荷宮頸癌U14小鼠模型的建立昆明小鼠飼養(yǎng)環(huán)境為室溫18℃~25℃,空氣濕度40%~60%,晝夜節(jié)律。墊料、籠具、飲水等高壓蒸汽滅菌處理,小鼠飼料為SPF級(jí)專(zhuān)用高壓滅菌飼料,更換墊料和籠具等操作在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。用生理鹽水稀釋U14宮頸癌細(xì)胞株到適宜的濃度(1×107個(gè)/ml),在每只小鼠的左前肢腋下注射,0.2 ml/只。

        1.8小鼠分組將小鼠隨機(jī)分為5組,每組10只:①空白對(duì)照組:正常飼養(yǎng),不予尾部靜脈注射;②陰性對(duì)照組:給藥14 d,隔天通過(guò)尾部靜脈的方法給予0.25 ml生理鹽水給藥;③陽(yáng)性對(duì)照組:給藥14 d,隔天通過(guò)尾部靜脈的方法給予0.25 ml環(huán)磷酰胺溶液給藥;④吡柔比星脂質(zhì)體組:給藥14 d,隔天通過(guò)尾部靜脈的方法給予0.25 ml吡柔比星脂質(zhì)體溶液給藥;⑤吡柔比星裸藥組:給藥14 d,隔天通過(guò)尾部靜脈的方法給予0.25 ml吡柔比星裸藥溶液給藥。

        1.9抑瘤率測(cè)定第14天處死小鼠后,取腫瘤組織,稱(chēng)取其質(zhì)量,計(jì)算抑瘤率:抑瘤率=(1-給藥組瘤質(zhì)量/陰性對(duì)照組平均瘤質(zhì)量)×100%。

        2 結(jié) 果

        2.1吡柔比星脂質(zhì)體的形貌吡柔比星脂質(zhì)體呈現(xiàn)一定的球狀形貌,視野內(nèi)脂質(zhì)體分布均勻,粒徑均一且圓整,粒徑約為140 nm。見(jiàn)圖1。

        圖1 吡柔比星脂質(zhì)體(TEM)

        2.2吡柔比星脂質(zhì)體的粒徑吡柔比星脂質(zhì)體的平均粒徑為(140.9±2.36)nm,與透射電鏡下觀察的粒徑一致,其多分散系數(shù)為0.203±0.01。吡柔比星脂質(zhì)體的粒徑分布呈正態(tài)分布,多分散系數(shù)表明粒徑分布比較集中,且達(dá)到了納米藥物的要求。因?yàn)槟[瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速度快,細(xì)胞間距大致在100~200 nm,而正常組織間距在50 nm左右。納米藥物最適宜的粒徑應(yīng)該在100~200 nm,這樣藥物更容易進(jìn)入腫瘤組織而不易進(jìn)入正常的組織間,從而發(fā)揮作用。

        2.3吡柔比星脂質(zhì)體的Zeta電位吡柔比星脂質(zhì)體的Zeta電位在(-14.2±2.64)mV,表明脂質(zhì)體具有一定的穩(wěn)定性,可以長(zhǎng)時(shí)間保存而不發(fā)生聚沉現(xiàn)象。

        2.4吡柔比星脂質(zhì)體的包封率用紫外分光光度計(jì)測(cè)在495 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吡柔比星濃度分別為5、10、15、20、30和40 μg/ml溶液的吸光度,吡柔比星的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.015 8x+0.061 4,R2=0.998 8。通過(guò)包封率計(jì)算公式可以計(jì)算得包封率為(75.1±3.5)%。

        2.5吡柔比星釋放曲線如圖2所示,吡柔比星裸藥快速釋放且在第4小時(shí)處完全釋放,而吡柔比星脂質(zhì)體前期釋放速度較快且逐漸變緩,吡柔比星脂質(zhì)體相比于吡柔比星裸藥具有一定的緩釋性。吡柔比星脂質(zhì)體可以緩釋吡柔比星,從而延長(zhǎng)其在體內(nèi)的保留時(shí)間,提高其藥效。

        圖2 吡柔比星裸藥與吡柔比星脂質(zhì)體釋放曲線

        2.6吡柔比星脂質(zhì)體對(duì)U14荷瘤小鼠腫瘤抑制作用吡柔比星脂質(zhì)體的抑瘤率可以達(dá)到(75.1±8.6)%,而吡柔比星裸藥的抑瘤率為(64.9±12.2)%,說(shuō)明吡柔比星可以抑制腫瘤的生長(zhǎng),而吡柔比星脂質(zhì)體對(duì)腫瘤具有更好的抑制作用。吡柔比星脂質(zhì)體可以提高吡柔比星的水溶性,其磷脂層可以介導(dǎo)藥物通過(guò)細(xì)胞膜。此外,吡柔比星脂質(zhì)體的增加滯留和滲透(EPR)效應(yīng)可以使藥物的被動(dòng)靶向到腫瘤組織。并且,吡柔比星脂質(zhì)體可以緩釋藥物,從而提高藥物的生物利用度。

        3 討 論

        本文以薄膜水化法制備吡柔比星脂質(zhì)體,薄膜水化法適用于脂溶性藥物脂質(zhì)體的制備,制備出的吡柔比星脂質(zhì)體呈紅色混懸體系。透射電鏡下觀察吡柔比星脂質(zhì)體的形貌,吡柔比星脂質(zhì)體圓整且粒徑均一,并且分散均勻,與粒徑的分散系數(shù)測(cè)定結(jié)果一致。吡柔比星脂質(zhì)體電位為-10.8 mV,可以是脂質(zhì)體保持穩(wěn)定,不產(chǎn)生絮凝。吡柔比星脂質(zhì)體可以緩釋吡柔比星,延長(zhǎng)其在體內(nèi)時(shí)間。吡柔比星脂質(zhì)體的粒徑可以使其通過(guò)EPR效應(yīng)進(jìn)入腫瘤組織。體外實(shí)驗(yàn)吡柔比星脂質(zhì)體組抑瘤率高于吡柔比星裸藥組,證明了吡柔比星脂質(zhì)體是很有潛力的抗腫瘤藥物。

        1Luo LM,Huang Y,Zhao BX,etal.Anti-tumor and anti-an-angiogenic effect of metronomic cyclic NGR-raodified liposomes containing paclitaxe〔J〕.Erials,2013;34(4):1102-14.

        2Alhariri M,Azghani A,Omri A.Liposomal antibiotics for the treatment of infectious diseases〔J〕.Exp Opin Drug Del,2013;10(11):1515-32.

        3Sun HY,Cacciarelli TV,Singh N.Micafungin versus amphotericin B lipid complex for the prevention of invasive fungal infections in high-risk liver transplant recipients〔J〕.Transplantation,2013;96(6):573-8.

        4Yogita PP,Sameer J.Novel methods for liposome preparation〔J〕.Chem Phys Lipids,2014;177:8-18.

        5王瑞蓮,劉成梅,劉偉.脂質(zhì)體制備方法的研究進(jìn)展〔J〕.農(nóng)產(chǎn)品加工學(xué)刊,2007;109(7):8-14.

        6Fujiwara A,Hoshino T,Westley JW.Anthracycline antibiotics〔J〕.Crit Rev Biotechnol,1985;3(2):133.

        7呂俊,丁念,朱家薔,等.蕙環(huán)類(lèi)藥物心臟毒性及其預(yù)防的研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2008;28(15):1302-6.

        8賈彥熹,賈英杰,趙成,等.吡柔比星聯(lián)合化療治療晚期腫瘤37例臨床觀察〔J〕.腫瘤研究與臨床,2005;17(1):59-60.

        〔2016-07-14修回〕

        (編輯曲莉)

        吉林大學(xué)橫向課題(2014220101000363)

        王麗萍(1963-),女,主任醫(yī)師,碩士生導(dǎo)師,主要從事腫瘤病理學(xué)研究。

        王學(xué)菊(1978-),女,主治醫(yī)師,主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。

        R73

        A

        1005-9202(2016)17-4174-02;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.017

        1秦皇島市第一醫(yī)院

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