劉天云

(天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院，天津 300070)

很多骨骼疾病是由破骨細(xì)胞的分化和功能異常引起的，如巨頜癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松等。因此，對(duì)破骨細(xì)胞分化和功能的研究成為攻克這些疾病的關(guān)鍵。破骨細(xì)胞由單核細(xì)胞分化而來，在體外實(shí)驗(yàn)中，多采用外周血單核細(xì)胞(PBMCs)、臍帶血單核細(xì)胞(UBMCs)和人類白血病單核細(xì)胞系U937和THP-1為前體細(xì)胞誘導(dǎo)得到破骨細(xì)胞樣細(xì)胞。破骨細(xì)胞分化需要兩個(gè)細(xì)胞因子——破骨細(xì)胞生成因子(RANKL)和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)［1］。PBMCs和 UBMCs直接在 RANKL和M-CSF的誘導(dǎo)下便可分化為破骨細(xì)胞樣細(xì)胞［1～3］。PBMCs和 UBMCs分化來的破骨細(xì)胞樣細(xì)胞更接近自然的破骨細(xì)胞，而U937和THP-1生成的破骨細(xì)胞樣細(xì)胞體積較小，核的數(shù)量也少。但是由于PBMCs和UBMCs的不能增殖且分離復(fù)雜，限制了對(duì)破骨細(xì)胞的研究。因此，最理想的單核細(xì)胞來源還是能夠無限增殖的單核細(xì)胞系。因?yàn)門HP-1中可以檢測到RANKL受體mRNA［6］，故我們嘗試用RANKL和M-CSF直接誘導(dǎo)THP-1，看是否可以得到更接近天然的破骨細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞因子RANKL和M-CSF購于美國Pepeotech公司，PMA購于美國Sigma公司，培養(yǎng)基RPMI粉末來自GIBCO公司，胎牛血清購于美國HyClone公司，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)試劑盒購于天津血液研究所，Ⅰ型膠原購于美國的Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用RPMI1640完全培養(yǎng)基，含100 U/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素和10%胎牛血清。細(xì)胞接種于75 ml培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，每3 d傳代換液。

1.2.2 玻璃片鋪膠原 將Ⅰ型膠原以1%的濃度溶于醋酸中，加入到鋪有玻璃片的48孔板中放置10 min，然后回收膠原，晾干。在接種細(xì)胞前用PBS清洗3次，晾干后使用。

1.2.3 誘導(dǎo)分化 將 THP-1細(xì)胞以1×105/ml的密度接種到鋪有玻璃片的48孔板中，加入濃度為1×107mmol/L的PMA刺激，每2 d換液除去未貼壁細(xì)胞，刺激4 d后停止。改加入RANKL(50 μg/ml)和 M-CSF(50 μg/ml)刺激，每3 d換液。

1.2.4 破骨細(xì)胞標(biāo)志物檢測 將玻璃片從培養(yǎng)板中取出，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破骨細(xì)胞特有標(biāo)記物——TRAP細(xì)胞化學(xué)染色。光鏡下觀察，TRAP陽性的多核細(xì)胞被稱作破骨細(xì)胞樣細(xì)胞。

2 結(jié)果

THP-1細(xì)胞在PMA刺激4 d后從懸浮單核細(xì)胞分化為貼壁細(xì)胞，細(xì)胞體積增大，向周圍鋪展(圖1)。刺激到第10天時(shí)出現(xiàn)TRAP陽性的破骨細(xì)胞樣細(xì)胞，與TPA/1，25(OH)2D3刺激得到的破骨細(xì)胞相比，體積大，細(xì)胞核數(shù)量多(圖2)。

圖1 貼壁巨噬細(xì)胞

圖2 破骨細(xì)胞樣細(xì)胞

3 討論

THP-1細(xì)胞是從急性單核細(xì)胞白血病衍生來的，TPA刺激后從懸浮狀態(tài)分化為貼壁細(xì)胞，停止增殖［7］。THP-1可以分化為巨噬細(xì)胞，而且與其他單核細(xì)胞系分化來的巨噬細(xì)胞相比，更接近自然的巨噬細(xì)胞［8］。這提示THP-1細(xì)胞本身就有更接近天然單核細(xì)胞的性質(zhì)。這可能是 THP-1可以在RANKL和M-CSF的誘導(dǎo)下分化為破骨細(xì)胞樣細(xì)胞的原因。

RANKL與其受體RANK結(jié)合后，通過多條信號(hào)通路激活多個(gè)核轉(zhuǎn)錄因子，這些核轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)。M-CSF是一種造血細(xì)胞生長因子，在破骨細(xì)胞分化過程中，它的主要作用是上調(diào)單核細(xì)胞內(nèi)RANK的表達(dá)和支持細(xì)胞存活。RANKL和M-CSF都由間充質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞分泌。RANKL和M-CSF聯(lián)合誘導(dǎo)分化是破骨細(xì)胞生成的經(jīng)典途徑，雖然有其他因子也可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化，但是沒有RANKL和M-CSF被完全取代的情況。在目前發(fā)現(xiàn)的所有非經(jīng)典途徑中RANKL是必須，而M-CSF可被其他因子替代。但是非經(jīng)典途徑中的細(xì)胞因子不能完全代償M-CSF的功能，生成的破骨細(xì)胞與經(jīng)典途徑得到的破骨細(xì)胞相比，在形態(tài)上或者功能上存在差異［9～12］。

TPA是人工合成的生物試劑，它能夠誘導(dǎo)THP-1和U937分化為巨噬細(xì)胞［8］，且刺激后能檢測到RANK的mRNA水平增高。應(yīng)用TPA之后，1，25(OH)2D3能夠繼續(xù)上調(diào)RANK的 mRNA的表達(dá)。1，25(OH)2D3能夠刺激成骨細(xì)胞分泌 RANKL，有報(bào)道1，25(OH)2D3在造血細(xì)胞HL-60中抑制c-fms的 mRAN 的表達(dá)，c-fms是 M-CSF 的受體［13，14］。這些都暗示TPA/1，25(OH)2D3誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化是與RANKL和M-CSF有密切關(guān)系的，是一條誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的非經(jīng)典途徑。在實(shí)驗(yàn)過程中，我們發(fā)現(xiàn)傳代太久的THP-1細(xì)胞不能被TPA誘導(dǎo)為完全的貼壁細(xì)胞，細(xì)胞短暫貼壁后又恢復(fù)為懸浮細(xì)胞。這可能由于細(xì)胞被傳代次數(shù)太多，致使細(xì)胞的性狀發(fā)生了輕微的改變，對(duì)某些因子的刺激不再敏感。TRAP是破骨細(xì)胞特有的標(biāo)志物，在以上試驗(yàn)中我們驗(yàn)證了THP-1在RANKL和M-CSF誘導(dǎo)能分化為TRAP陽性的破骨細(xì)胞樣細(xì)胞。在我們接下來的試驗(yàn)中將驗(yàn)證這些破骨細(xì)胞樣細(xì)胞的破骨功能。

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