朱永香,王 倩,賈 敏,王 爽 ,楊 穎,于 瑋,曹 健 ,南 瑛

神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y,NPY)是由36個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈多肽,屬于胰多肽家族,廣泛分布于大腦皮層、紋狀體腹側(cè)及背側(cè)以及多個(gè)邊緣結(jié)構(gòu)包括下丘腦(hypothalamus)和杏仁核(amygdala)[1],是最重要的調(diào)節(jié)進(jìn)食的神經(jīng)肽,具有較強(qiáng)的促食欲作用,NPY的Y1與Y 5受體參與調(diào)節(jié)NPY對(duì)食欲的刺激作用[2]。有研究顯示,大鼠攝入含有蔗糖的飼料后腦干的NPY mRNA明顯增多[3],說明NPY可能參與了甜味覺信息的評(píng)估過程。杏仁中央核是參與味覺信息評(píng)估的重要核團(tuán),該核團(tuán)內(nèi)含有豐富的NPY[1],也含有中等量NPY的Y1受體[4]。由此推測(cè)NPY可能參與了杏仁中央核對(duì)味覺信息的評(píng)估機(jī)制,從而調(diào)控?cái)z食行為。關(guān)于NPY在杏仁中央核是否參與味覺調(diào)控的相關(guān)報(bào)道很少見。為此,本研究采用免疫組織化學(xué)方法觀察了蔗糖甜味覺刺激對(duì)大鼠杏仁中央核內(nèi)NPY及FOS表達(dá)的影響,為進(jìn)一步探索NPY在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的促食欲作用及其與肥胖的關(guān)系提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 成年健康SD大鼠16只,雄性,體質(zhì)量 220 g～250 g,自由攝食、飲水,動(dòng)物房溫度維持在(20±3)℃,光暗周期為12 h︰12 h,實(shí)驗(yàn)前在上述條件下喂養(yǎng) 2 d。多克隆兔抗大鼠NPY抗體,購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司,多克隆兔抗大鼠c-FOS抗體(Sc-52)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司,SP試劑盒(羊抗兔)及DAB濃縮型試劑盒均購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。主要儀器有顯微鏡(O lympus,BX51)、照相機(jī)(Spot Insight,U 3.5)、圖像分析軟件(Image-Pro Plus 6.0)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型及分組 將動(dòng)物隨機(jī)分為 2組,每組8只,分別為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。將大鼠禁水20 h后,在 09:30時(shí)給予對(duì)照組大鼠15 m L蒸餾水,給予實(shí)驗(yàn)組大鼠15 m L蔗糖溶液(1 mol/L),30m in后,為了避免大鼠脫水,給對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組大鼠飲60m in的自來水,連續(xù)訓(xùn)練4 d。第5天即實(shí)驗(yàn)當(dāng)天09:30時(shí),給對(duì)照組大鼠15 m L蒸餾水,給實(shí)驗(yàn)組大鼠15 m L蔗糖溶液(1 mo l/L),飲用30 m in,2 h后腹腔注射烏拉坦(1.2 g/kg)麻醉,打開胸腔,經(jīng)左心室-主動(dòng)脈插管,用100 m L生理鹽水迅速灌注沖洗血液,40 g/L多聚甲醛固定液(0.1 mol/LPB配制,pH值7.4)400 m L灌流約90m in。斷顱取腦,置入固定液,在4℃下保存4 h～6 h,再轉(zhuǎn)入200 g/L蔗糖溶液(0.1 mo l/L PB配制,pH值7.4)在4℃下過夜。做冰凍冠狀切片,片厚 40μm,收集于PBS中。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 采用SP免疫組織化學(xué)染色,洗腦片(PBS 0.01 mol/L);0.3%(m L/L)H2O2孵育30 min;洗片(5 m in×3),0.3%(m L/L)TritionX-100室溫孵育 40 m in;洗片;正常山羊血清封閉,室溫60m in;兔抗大鼠NPY抗體(1︰300)孵育腦片,或兔抗大鼠c-FOS抗體(1︰500)孵育腦片,4℃下孵育36 h;洗片;生物素標(biāo)記羊抗兔IgG(1︰300)室溫孵育1 h,洗片;S-A/HRP室溫孵育1 h,洗片,DAB顯色3 min;PBS沖洗終止反應(yīng),裱片、脫水、透明、封片。

1.2.3 圖像采集 ①NPY免疫組化圖像采集:每只大鼠選取有杏仁中央核連續(xù)5張切片,在400倍鏡下,每張切片選取杏仁中央核的同一區(qū)域拍照。細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。采用圖像分析軟件(Image-Pro Plus 6.0,IPP 6.0)對(duì)NPY免疫陽(yáng)性物進(jìn)行半定量檢測(cè),測(cè)量 NPY免疫陽(yáng)性細(xì)胞總面積(sum of area,SA)和累積光密度(integraloptical density,IOD)。分析過程中所有切片的放大倍數(shù)、光源強(qiáng)度均相同。②FOS表達(dá)免疫組化圖像采集:每只大鼠選取有杏仁中央核連續(xù)5張切片,在400倍鏡下,每張切片選取杏仁中央核的同一區(qū)域拍照。細(xì)胞核中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為FOS陽(yáng)性細(xì)胞。應(yīng)用IPP 6.0軟件進(jìn)行圖像分析,兩側(cè)的平均值作為該核團(tuán)內(nèi)特定范圍的單側(cè)FOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理,采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(表示,組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠杏仁中央核內(nèi)NPY表達(dá)水平比較(見表1)

2.2 兩組大鼠杏仁中央核內(nèi)NPY免疫組織化學(xué)染色(見圖1、圖 2)

2.3 兩組大鼠杏仁中央核內(nèi)FOS表達(dá)水平比較 對(duì)照組大鼠杏仁中央核內(nèi)FOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)20.51±6.53,實(shí)驗(yàn)組為44.28±10.49,與對(duì)照組相比,給大鼠蔗糖甜味覺刺激后誘導(dǎo)杏仁中央核內(nèi)FOS免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)顯著增加(P<0.05)。

2.4 兩組大鼠杏仁中央核內(nèi)FOS免疫組織化學(xué)染色(見圖3、圖 4)

表1 兩組大鼠杏仁中央核內(nèi)NPY表達(dá)水平(x±s)

3 討論

NPY是中樞神經(jīng)系統(tǒng)含量最豐富的神經(jīng)肽之一,是最重要的調(diào)節(jié)進(jìn)食的神經(jīng)肽。給大鼠側(cè)腦室、下丘腦室旁核、下丘腦背內(nèi)側(cè)核及下丘腦其他部位注射NPY,均能導(dǎo)致食欲亢進(jìn),尤其富含糖類的食物攝入量明顯增加[5,6]。反復(fù)注射NPY則引起肥胖。動(dòng)物饑餓時(shí),下丘腦室旁核中NPY的釋放顯著增加,哺乳期母體對(duì)能量的需求增加,在弓狀核-下丘腦室旁核軸中伴隨出現(xiàn)NPY能信號(hào)增強(qiáng)。因此,普遍認(rèn)為NPY的增食欲作用是下丘腦調(diào)節(jié)的,特別是從弓狀核發(fā)出的投射到下丘腦室旁核的NPY能神經(jīng)元,NPY的Y1與Y5受體參與調(diào)節(jié)NPY對(duì)食欲的刺激作用[2]。有研究表明,給大鼠第四腦室或側(cè)腦室注射NPY均能增加蔗糖溶液的攝入量,提示NPY的促食欲作用與可口味覺刺激有關(guān)[7,8]。Torregrossa 等[9]為了 確定NPY的促食欲作用主要是通過增加可口的甜味覺刺激作用還是由于減弱了消化后的負(fù)反饋抑制作用引起的,將NPY分別注入假飼和真飼大鼠的第三腦室,觀察到假飼大鼠對(duì)蔗糖溶液的攝入量大于真飼大鼠,因此,他們認(rèn)為NPY的促食欲作用主要是增加可口的甜味覺刺激引起的。有研究證實(shí)杏仁核參與味覺及攝食調(diào)控[10-12]。其兩個(gè)重要亞核杏仁中央核(central nucleus of the amygdala,CeA)和杏仁基底外側(cè)核(basolateral amygdala,BLA)在味覺及攝食功能的調(diào)控中起不同作用。杏仁中央核起正調(diào)控作用,可增加進(jìn)食量,它對(duì)攝食的調(diào)控可能是通過食物引起的情感反應(yīng)而影響對(duì)食物的喜好;杏仁基底外側(cè)核進(jìn)行負(fù)調(diào)控,可減少攝食量,降低體質(zhì)量。損毀杏仁中央核的大鼠對(duì)各種味覺刺激的攝入量均下降,說明杏仁中央核可能通過影響中樞味覺的評(píng)估機(jī)制,改變大鼠對(duì)不同味覺刺激的欣快閾值,進(jìn)而調(diào)節(jié)攝食。由于杏仁中央核內(nèi)有NPY及其Y1受體的存在,另外,攝食行為在很大程度上是由味覺引導(dǎo)的,因此,我們推測(cè)NPY可能也參與了杏仁核對(duì)味覺信息的評(píng)估機(jī)制,從而調(diào)控?cái)z食行為。本研究發(fā)現(xiàn),給大鼠1 mol/L的蔗糖甜味覺刺激后引起杏仁中央核內(nèi)FOS表達(dá)的顯著增加,提示杏仁中央核內(nèi)的神經(jīng)元參與了蔗糖的欣快味覺信息的評(píng)估機(jī)制;另外,給大鼠1mol/L的蔗糖甜味覺刺激后還引起杏仁中央核內(nèi)NPY表達(dá)的顯著增加,提示杏仁中央核內(nèi)的 NPY能神經(jīng)元可能參與了蔗糖的可口味覺信息的評(píng)估機(jī)制。

綜上所述,蔗糖的可口味覺刺激可能激活了杏仁中央核內(nèi)的NPY能神經(jīng)元,引起NPY的產(chǎn)生和釋放增加。因此,有理由推測(cè),NPY在杏仁中央核內(nèi)可能參與了可口甜味覺食物的促食欲機(jī)制。

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