王慶麗，趙慧穎，馬小欣

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 心血管中心，吉林 長春 130021；2.寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院，浙江 寧波 315000）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是多種病因及易患因素共同作用的結(jié)果，慢性炎癥在AS的形成及發(fā)展中具有重要作用。單核/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞是參與AS的主要炎癥細(xì)胞，而巨噬細(xì)胞來源于循環(huán)中的單核細(xì)胞，單核細(xì)胞進(jìn)入血管壁是AS發(fā)生的關(guān)鍵步驟。單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）是誘導(dǎo)單核細(xì)胞遷移的誘導(dǎo)劑，參與泡沫細(xì)胞形成及AS的發(fā)生、發(fā)展全過程。近年研究發(fā)現(xiàn)腎素-血管緊張素 -醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）參與AS的發(fā)病，且MCP-1蛋白的表達(dá)與RAAS系統(tǒng)的激活密切相關(guān)，但具體機(jī)制尚不完全清楚。本研究通過構(gòu)建大鼠動脈粥樣硬化模型，采用免疫組化半定量分析法研究斑塊中AT1R和MCP-1蛋白表達(dá)的關(guān)系，探討血管緊張素受體阻斷劑-纈沙坦的抗動脈粥樣硬化作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性Wistar大鼠，體重在220～250 g，購自吉林大學(xué)實驗動物中心。

1.2 藥物及試劑

纈沙坦（代文）為北京諾華制藥有限公司贈與，膽固醇、膽酸鈉購自湖南祁東縣同信生化廠，丙基硫氧嘧啶購自上海復(fù)星朝暉藥業(yè)有限公司，維生素D3粉購自北京華明盛商貿(mào)發(fā)展有限公司，兔抗鼠MCP-1一抗、AT1R一抗購于廣州市寶泰克生物科技有限公司，SP試劑盒和液體DAB酶底物顯色試劑盒購于廣州市寶泰克生物科技有限公司，抗原修復(fù)液、防脫片、消化液等購于福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3 動物分組

將30只健康雄性Wistar大鼠（體重220～250 g），隨機(jī)分為以下3組：①正常對照組（10只），②動脈硬化組（10只），③纈沙坦組（10只）。正常對照組行假球囊損傷手術(shù)給予正常飲食；余2組每只大鼠給予30萬u/kg體重維生素D3右下肢肌肉注射后用球囊行動脈拉傷，在基礎(chǔ)飼料中加入2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、維生素D3粉劑（1.25×106u/kg飼料）、3%豬油等飼養(yǎng)。纈沙坦組同時給予纈沙坦30 mg/kg體重，1次/d次灌胃。喂養(yǎng)9周后空腹24 h抽血并處死，檢測血脂水平，自主動脈弓下約1.0 cm處留取動脈組織1.0 cm用4%甲醛溶液固定，行HE染色及免疫組化分析。球囊拉傷過程如下[1]：戊巴比妥鈉30 mg/kg體重腹腔麻醉后，常規(guī)消毒，于胸骨上約1 cm處切開左側(cè)頸部皮膚，分離左頸總動脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，近心端用手術(shù)線拉起阻斷血流，滴硝酸甘油數(shù)滴于頸總動脈上，切開動脈前壁約1.0 mm小口，將內(nèi)徑為1.5 mm，長20.0 mm球囊向近心端插入，進(jìn)入約8.0 cm，球囊內(nèi)注入0.2 mL生理鹽水，來回拉動3、4次，放水再進(jìn)約8.0 cm，注水、回拉，共3次。拔出球囊，結(jié)扎近心端。消毒、縫合皮下組織、皮膚。假球囊損傷手術(shù)為切開左側(cè)頸部皮膚，分離左側(cè)頸總動脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端和近心端，剪斷動脈，但不插球囊管。

1.4 血脂檢測

9周末大鼠空腹24 h后，戊巴比妥鈉30 mg/kg體重腹腔麻醉后，在腎動脈分叉處取血，離心（3 000 r/min，15 min），取血清1.0mm采用全自動生化分析儀（XL20）檢測總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL-C）和低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL-C）。在吉林大學(xué)第一臨床醫(yī)院生化科完成。

1.5 動脈組織H-E染色及免疫組化染色

9周后處死動物，取主動脈全段，生理鹽水沖洗后觀察，自主動脈弓下約1.0 cm處留取動脈組織用4%甲醛溶液固定、脫水、石蠟包埋后切片，行HE及免疫組化染色。用高倍顯微鏡觀察血管內(nèi)膜和中膜的變化。免疫組化染色法取制備好的切片（厚度為5μm）分別加入抗血管緊張素Ⅱ-1型抗體（兔抗鼠多克隆抗體1∶150）、抗單核細(xì)胞趨化蛋白抗體（兔抗鼠多克隆抗體，1∶150），采用S-P法，DAB顯色，脫水透明后中性樹脂封固。正常對照組實驗用PBS取代一抗，其余步驟同上，以上步驟嚴(yán)格按照試劑說明進(jìn)行，棕黃色產(chǎn)物為陽性染色。采用CHA型雙目光學(xué)顯微攝影系統(tǒng)及Luzex-F圖象分析軟件進(jìn)行圖像分析，在圖像分析系統(tǒng)上，每個切片隨機(jī)取5個高倍視野，每個視野測定一定面積內(nèi)陽性信號面積和陽性信號平均灰度，MCP-1蛋白質(zhì)表達(dá)半定量的結(jié)果以陽性信號指數(shù)表示，取均值后計算抗原陽性信號指數(shù)。計算公式：陽性信號指數(shù)=信號面積×陽性信號平均灰度/測定面積×100，計算各自的陽性表達(dá)。AT1R在血管的陽性表達(dá)以面密度表示，同上述方法測5個視野，計算公式：面密度=目標(biāo)總面積/統(tǒng)計場總面積。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件包進(jìn)行分析。行方差分析，各組均數(shù)間用Student-Newman-Keuls法行兩兩比較，以（±s）表示，檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 血脂水平變化

9周后動脈硬化組和纈沙坦組與正常對照組比較，TC、TG和LDL-C 明顯升高（P＜0.01），HDL-C明顯降低（P＜0.01），而動脈硬化組和纈沙坦組之間無明顯差異（P＞0.05）。見表 1。

2.2 各組動脈組織病理形態(tài)學(xué)檢測

正常對照組肉眼可見內(nèi)膜光滑，無斑塊形成；動脈硬化組血管內(nèi)膜表面粗糙，凹凸不平，大量黃白色斑塊突出于管腔表面，并連接成片，以近主動脈弓處及血管開口處最為明顯，有的部位呈同心性環(huán)狀。纈沙坦組可見散在的白色斑塊突出于管腔表面，主要集中在血管開口處，較少連接成片。HE染色可見正常對照組血管分層清晰，內(nèi)膜完整，內(nèi)皮連續(xù)，中層平滑肌細(xì)胞排列正常無增生，外層為疏松結(jié)締組織；動脈硬化組可見明顯的動脈粥樣硬化斑塊形成，動脈內(nèi)膜呈偏心性增厚，斑塊內(nèi)充滿泡沫細(xì)胞，內(nèi)膜有少量炎細(xì)胞及增生的平滑肌細(xì)胞，中層平滑肌細(xì)胞明顯增生，伴有點(diǎn)狀和片狀鈣化；纈沙坦組與動脈硬化組比較，血管內(nèi)膜、中膜平滑肌細(xì)胞增生均明顯減輕，內(nèi)膜和中膜的分層較清晰，平滑肌細(xì)胞與正常對照組比較排列紊亂，其間可見少量散在的脂質(zhì)沉積和泡沫細(xì)胞。見圖1。

表1 實驗9周后各組血脂變化情況 （mmol/L，±s）

表1 實驗9周后各組血脂變化情況 （mmol/L，±s）

注：動脈硬化組和纈沙坦組較正常對照組相比，血脂明顯升高（?P＜0.01）；正常對照組：正常飲食；動脈硬化組：高脂飲食；纈沙坦組：高脂飲食，并給予纈沙坦飲食.

組別 TG TC LDL-C HDL-C正常對照組 0.39±0.07? 2.74±0.48? 1.93±0.31? 1.75±0.26?動脈硬化組 0.81±0.14 7.14±0.76 6.22±0.18 0.80±0.33纈沙坦組 0.83±0.11 7.05±0.71 6.24±0.29 0.79±0.27

2.3 各組大鼠主動脈內(nèi)膜、中膜AT1R的陽性表達(dá)及半定量分析

圖1 各研究組大鼠胸主動脈的HE染色結(jié)果

圖2 各研究組大鼠胸主動脈的AT1R免疫組化染色結(jié)果

正常對照組血管內(nèi)膜、中膜均未見明顯的AT1R陽性表達(dá)；動脈硬化組的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞AT1R表達(dá)均明顯增多呈深褐色，部分呈點(diǎn)狀、片狀著色；纈沙坦組偶見內(nèi)皮細(xì)胞有AT1R表達(dá)（見圖2）。AT1R的陽性表達(dá)用面密度表示：動脈硬化組與法纈沙坦組、正常對照組比較，動脈內(nèi)膜及中膜AT1R表達(dá)明顯升高（P＜0.001）；纈沙坦組與正常對照組比較，AT1R的表達(dá)亦有升高，但兩組間比較無明顯差異（P＞0.05）。

2.4 大鼠主動脈內(nèi)膜、中膜MCP-1蛋白的陽性表達(dá)及半定量分析

正常對照組未見明顯MCP-1蛋白陽性表達(dá)；動脈硬化組的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞胞漿中可見大量MCP-1蛋白陽性表達(dá)，為深褐色，呈點(diǎn)狀或片狀著色；纈沙坦組的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞胞漿中可見少量MCP-1蛋白陽性表達(dá)。見圖3。MCP-1蛋白的陽性表達(dá)用陽性信號指數(shù)表示：動脈硬化組與纈沙坦組、正常對照組比較，動脈內(nèi)膜、中膜MCP-1蛋白表達(dá)均明顯升高（P＜0.001）；而纈沙坦組仍高于正常對照組（P＜0.05）。各實驗組動脈組織中AT1R和MCP-1蛋白表達(dá)的半定量分析比較。見表2。

表2 實驗9周后各組血管組織中AT1R和MCP-1蛋白的陽性表達(dá)情況

圖3 各研究組大鼠胸主動脈的MCP-1免疫組化染色結(jié)果

3 討論

AS是多種病因及易患因素共同作用的結(jié)果，最近有人提出了動脈粥樣硬化是一種長期的慢性炎癥性病理過程，斑塊的形成涉及脂類代謝障礙、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常、巨噬細(xì)胞浸潤、血管平滑肌細(xì)胞增殖和血小板聚集等多種因素。大量研究已經(jīng)表明，RAAS參與了AS的病理過程，AngⅡ可與細(xì)胞膜結(jié)合促進(jìn)低密度脂蛋白的氧化及攝取、影響內(nèi)皮細(xì)胞功能[2-4]，目前臨床中應(yīng)用ACEI類和ARB類拮抗RAAS系統(tǒng)的藥物來降低血壓、改善心肌重構(gòu)等降低臨床的心血管事件。而對于ACEI和ARB類藥物除降壓、改善心肌重構(gòu)外，對心血管系統(tǒng)的其它作用仍需進(jìn)一步的研究。本實驗采用免疫組化法檢測在高脂飲食基礎(chǔ)上形成AS時血管組織中AT1R和MCP-1蛋白表達(dá)的變化以及纈沙坦對二者表達(dá)的影響，探討纈沙坦抗AS作用及可能機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在主動脈AS斑塊中AT1R和MCP-1蛋白表達(dá)均明顯升高，且AS斑塊中AT1R和MCP-1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.635）；而纈沙坦組與動脈硬化組比較，AT1R的表達(dá)被明顯抑制，二者有明顯的差異（P＜0.001），纈沙坦組與正常對照組比較AT1R的表達(dá)也有所升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；纈沙坦組的MCP-1蛋白表達(dá)與動脈硬化組比較明顯降低（P＜0.001），與正常對照組比較明顯升高（P＜0.05）。這一結(jié)果表明RAAS系統(tǒng)的激活對AS的發(fā)生、發(fā)展有著直接影響，并且RAAS系統(tǒng)被激活后通過AT1R又增加了MCP-1蛋白表達(dá)，促進(jìn)了AS的進(jìn)展。而纈沙坦通過拮抗AT1R的表達(dá)抑制了MCP-1蛋白表達(dá)起到了抗AS的作用。

當(dāng)血管壁發(fā)生AS病變時，血管壁上的AngⅡ產(chǎn)生會明顯增多，資料表明：AngⅡ誘導(dǎo)AS病變的增強(qiáng)，是由AngⅡ直接作用于有AS病變的血管壁細(xì)胞，激活了炎癥系統(tǒng)，引起IL-6、TNF等炎性介質(zhì)釋放增加和MCP-1、CCR2等化學(xué)增活素的基因表達(dá)增強(qiáng)，并且增加的AngⅡ的濃度和活性可以正反饋的增加AngⅡ的產(chǎn)生[5]。AT1R是RAAS系統(tǒng)激活后AngⅡ作用于血管壁導(dǎo)致AS發(fā)生、發(fā)展的必要受體，AT1R在AS時表達(dá)增多并通過促進(jìn)MCP-1蛋白表達(dá)，促進(jìn)了單核/巨噬細(xì)胞的聚集和內(nèi)移參與了AS的形成過程，并且在中晚期可以促進(jìn)平滑肌細(xì)胞移行和增殖參與了AS的進(jìn)展[6]。也有文獻(xiàn)報道AngⅡ促進(jìn)AS與血管平滑肌細(xì)胞過早凋亡有關(guān)[7]。AT1R的激活在AS發(fā)病機(jī)制中可能與多種細(xì)胞因子的激活有關(guān)，在AT1R基因敲除鼠中可以抑制高脂飲食所致的血管氧化應(yīng)激、內(nèi)皮細(xì)胞功能異常和AS的形成；也可以抑制高膽固醇飲食引起的全身組織中血管緊張素原和血管緊張肽的增加[8-9]。AT1受體拮抗劑在家兔AS模型中通過抑制斑塊中單核細(xì)胞的聚集和增加膠原纖維的沉積，可以起到增加斑塊穩(wěn)定性，減少斑塊破裂的作用[10]。

本研究結(jié)果表明在AS斑塊中AT1R和MCP-1蛋白表達(dá)均明顯增加，給予纈沙坦干預(yù)的治療組通過抑制AT1R的表達(dá)，抑制了血管組織中MCP-1蛋白的表達(dá)，起到了抗AS的作用，提示了纈沙坦通過抑制MCP-1蛋白的表達(dá)可以起到抗AS的作用。同時纈沙坦組MCP-1蛋白的表達(dá)仍高于正常對照組，說明高脂飲食及球囊損傷誘發(fā)的動脈粥樣硬化還與RAAS系統(tǒng)激活、MCP-1蛋白表達(dá)增加以外的其他因素參與有關(guān)[11]。

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