覃林芳

（湖南省婦幼保健院，湖南 長沙 410008）

子癇前期（pre-eclampsia）是嚴重的妊娠并發(fā)癥，在世界范圍內仍是孕產(chǎn)婦死亡的主要原因之一[1-2]。其發(fā)生可能與導致“胎盤淺著床”的胎盤灌注減少，滋養(yǎng)細胞缺血缺氧有關。子癇前期是一種交感縮血管的激活狀態(tài)，神經(jīng)肽Y具有縮血管作用，其在子癇前期的發(fā)病過程中有重要作用。故探討NPY在子癇前期患者胎盤中的表達變化有著重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2008年6月～2009年6月在湖南省婦幼保健院住院分娩的25例重度子癇前期孕婦、25例輕度子癇前期孕婦作為研究組，隨機選擇同期分娩的正常孕婦25例作為對照組。即：A組：重度子癇前期組；B組：輕度子癇前期組；C組：正常孕婦組。以上3組婦女平均年齡差異無顯著性，P＞0.05，孕周、體重指數(shù)差異無顯著性，P＞0.05（見表1）。且均以剖宮產(chǎn)分娩，無胎膜早破及感染征象，排除其他妊娠合并癥。子癇前期診斷及分類標準參照全國統(tǒng)編教材《婦產(chǎn)科學》第6版。

表1 3組婦女年齡、孕周、體重指數(shù)比較 （n=25，±s）

表1 3組婦女年齡、孕周、體重指數(shù)比較 （n=25，±s）

組別 列數(shù) 年齡/歲 孕周 體重指數(shù)A 組 25 27.83±2.79 38.96±2.12 29.56±2.34 B 組 25 27.96±2.24 38.95±1.98 29.48±2.75 C 組 25 27.68±3.17 38.97±2.06 29.61±3.02 P P＞0.05 P＞0.05 P＞0.05

1.2 主要試劑

兔抗人NPY基因抗體，山羊抗兔抗體，β-actin兔抗人多克隆抗體和辣根酶標記山羊抗兔IgG抗體（武漢博士德生物技術公司）。RT-PCR兩步法試劑盒（北京賽百盛基因技術有限公司），AMV逆轉錄試劑盒（杭州博日），耐熱性Taq DNA聚合酶（大連寶生物T程公司），100bp DNA ladder（華美生物T程公司），TaKaRa RNA PCR kit（TaKaRa公司），Western blot蛋白檢測試劑盒（KPL公司，美國），HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。

1.3 胎盤標本留置及HE染色

胎盤娩出后立即在直視下剪取胎盤母體面中央1.0 cm×1.0 cm×0.6 cm大小無鈣化、無機化的胎盤組織，生理鹽水沖洗表面血液和分泌物后，截取50 mg左右液氮凍存，剩余的用左右10%甲醛固定6～12 h，石蠟包埋，制成4μm厚切片。采用HE染色在光鏡下觀察胎盤組織的病理特征。

1.4RT-PCR

分別將液氮凍存的各組病例病理組織取出，每個樣本取50 mg進行RT-PCR分析。采用Trizol試劑說明書介紹的方法提取組織總RNA，紫外分光光度計測定RNA含量，利用RT-PCR兩步法試劑盒說明將mRNA逆轉錄成cDNA，然后再將cDNA進行PCR擴增。按AMV逆轉錄試劑盒的操作說明將mRNA逆轉錄為cDNA。NPY引物：上游：5'-GCTAG GTAACAAACGAATGGGG-3'，下游：5'-CACAGTGTT GAAGATGGTAAG-3'，擴增片段長288 bp；內參β-actin上游：5'-CCATCATGAAGTGTGACGTTG-3'下游：5'-ACAGAGTACTTGCGCTCAGGA-3'（由天津賽爾生物技術有限公司合成），擴增片段長175 bp。PCR 反應條件：94℃變性 1 min，55℃退火 45 s，68℃延伸1 min，32個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。每一PCR反應重復3次。取PCR擴增產(chǎn)物進行電泳，電泳結果用凝膠圖像分析系統(tǒng)進行電泳條帶光密度分析，計算NPY產(chǎn)物與β-actin產(chǎn)物的光密度積分的比值，作為NPY mRNA表達的指標，從基因水平檢測子癇前期患者胎盤中神經(jīng)肽Y的表達。

1.5 Western Blot

將RT-PCR提取后剩余物以1 500 r/min離心30 min后，取上清粗體蛋白質，Bradford法測定蛋白濃度。5%濃縮膠40 V衡壓1 h，10%分離膠60 V恒壓3.5 h，濕轉14 V恒壓14 h，于37℃搖床封閉2h，洗膜10 min，3次，將NPY多克隆抗體1∶500稀釋溶于TBST中，室溫孵育60 min；TBST洗膜10 min，3次，加入1∶2 000稀釋的堿性磷酸酶標記的兔抗人抗體。室溫孵育60 min；TBST洗膜10 min。3次再用TBS洗膜10 min DAB顯色，Quantity one圖像分析，目的條帶灰度值除以β-actin灰度值進行結果分析，從蛋白水平檢測子癇前期患者胎盤中神經(jīng)肽Y的表達。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 胎盤標本HE染色

湖南省婦幼保健院住院分娩的25例重度子癇前期孕婦胎盤石蠟病理標本HE染色（見圖1），可見胎盤組織中合體細胞結節(jié)纖維素樣壞死顯著增多；25例輕度子癇前期孕婦胎盤組織石蠟病理標本HE染色（見圖2），可見胎盤組織中合體細胞結節(jié)纖維素樣壞死較多；25例正常孕婦胎盤組織石蠟病理標本HE染色（見圖3），可見胎盤組織中合體細胞結節(jié)纖維素樣壞死較少。

圖1 重度子癇前期孕婦胎盤組織HE染色（×10）

圖2 輕度子癇前期孕婦胎盤組織HE染色（×10）

圖3 正常孕婦胎盤組織HE染色（×10）

2.2RT-PCR

NPY mRNA在患者胎盤組織中表達：在重度子癇前期孕婦胎盤組織中表最高，在輕度子癇前期孕婦胎盤組織中表次之，在正常孕婦胎盤組織中表最低，各組的間差異有顯著性（P＜0.05）。結果見圖4、5，表 2。

圖4NPY mRNA電泳條帶圖

2.3 Western Blot

NPY蛋白在患者臍血管組織中表達：在患者胎盤組織中表達：在重度子癇前期孕婦胎盤組織中表最高，在輕度子癇前期孕婦胎盤組織中表次之，在正常孕婦胎盤組織中表最低，各組的間差異有顯著性（P＜0.05）。結果見圖6、7，表 2。

圖6 NPY蛋白電泳條帶圖

圖7 各組NPY蛋白相對表達量

表2 各組盤臍血管組織中NPY mRNA的比較 （±s）

表2 各組盤臍血管組織中NPY mRNA的比較 （±s）

注：各組間的差異有顯著性（P＜0.05）

檢測指標 NPY mRNA（NPY/β-actin） NPY protein（NPY/β-actin）重度子癇前期組 1.17±0.21 1.86±0.25輕度子癇前期組 0.72±0.11 1.53±0.22正常孕婦組 0.49±0.08 1.04±0.17

3 討論

子癇前期是妊娠晚期的一種高血壓癥狀，胎兒分娩后不久即能自然好轉。盡管這種高血壓癥可逆性的具體病理機制還有待進一步的探討，但是現(xiàn)在很清楚的是子癇前期具有周圍血管阻力明顯增加的特點，反過來，血壓上升又進一步加重了子癇前期的病情[3-5]。近年來的研究表明，子癇前期的發(fā)生與交感縮血管神經(jīng)過度激活、血管內皮細胞損傷等因素有關[6-8]。實驗研究證明子癇前期患者血漿NPY水平高于正常妊娠者，特別是重度子癇前期及子癇期病人，且隨著子癇前期病情的加重，NPY呈上升趨勢，用放免法測血漿中NPY發(fā)現(xiàn)，子癇前期組明顯升高[9-10]。

本實驗在前人研究的基礎上通過采用RT-PCR、Western-Blot的方法檢測輕度子癇前期、重度子癇前期和正常妊娠胎盤組織中神經(jīng)肽Y mRNA及其蛋白的表達量。研究結果發(fā)現(xiàn)神經(jīng)肽Y mRNA及其蛋白在患者病理組織中表達：重度子癇前期組最高，輕度子癇前期組次之，正常妊娠組最低，各組間的差異有顯著性（P＜0.05）。HE染色可見子癇前期組胎盤組織中，合體細胞結節(jié)纖維素樣壞死顯著增多等病理變化，與對照組相比差異有顯著性。即子癇前期婦女胎盤NPY表達水平隨子癇前期嚴重程度的增加有上升趨勢。該結果與章榮[9]和KHATUN[10]等對子癇前期患者血漿NPY水平的變化相一致。但是EGERMAN等[11]的實驗研究發(fā)現(xiàn)子癇前期患者與正常孕婦的NPY水平差異無顯著性，分別為（33.3±3.6）pg/mL 和（32.2±3.5）pg/mL。

目前研究認為，NPY在子癇前期中的作用機制可能為：NPY濃度升高首先可通過抑制腺甘酸環(huán)化酶使細胞內的cAMP的濃度下降，導致cAMP/cGMP值下降，從而利于細胞內Ca2+動員而直接收縮小動脈。子癇前期婦女胎盤內高水平的NPY直接收縮血管，增強縮血管物質的作用，使血管收縮，加重胎盤缺氧，缺氧的結果使交感神經(jīng)興奮性增加，交感神經(jīng)末梢則會分泌更多的NPY進入血液循環(huán)，故血漿NPY水平上升。NPY可使外周血管對縮血管物質的反應敏感性增加，并顯著增強去甲腎上腺素和組織氨以及血管緊張素Ⅱ、內皮素等的作用，使血壓進一步升高，導致病情進一步惡化。由此可見，子癇前期患者胎盤組織中神經(jīng)肽Y mRNA及其蛋白的高表達對病情發(fā)展惡化有重要作用。為臨床NPY抑制劑和NPY受體拮抗劑提供了理論依據(jù)。

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