趙云靜，孫洪偉，李書娟，麻宏偉

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 發(fā)育兒科，遼寧 沈陽 110004；2.沈陽醫(yī)學(xué)院奉天醫(yī)院 兒科，遼寧 沈陽 110024；3.遼陽石油化纖公司職工醫(yī)院 兒科，遼寧 遼陽 111003）

Forkhead box P2（FOXP2）基因位于 7q31，是2001年人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)言語相關(guān)基因，F(xiàn)OXP2基因突變可以導(dǎo)致嚴(yán)重的語言和言語障礙[1-2]。FOXP2基因的編碼產(chǎn)物FOXP2蛋白作為一種轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控其它基因的表達(dá)[3]。FOXP2基因是有關(guān)語言及言語障礙性疾病的重要候選基因。但我國目前有關(guān)FOXP2基因的研究少見，因此該基因的多態(tài)性在我國人群中的分布規(guī)律及特點(diǎn)尚不清楚?；蚨鄳B(tài)性在不同種族間差異很大，了解基因的多態(tài)性有利于明確人類種族差異，并且可用于進(jìn)行復(fù)雜性疾病的基因定位、疾病易感性研究。本研究選取FOXP2基因內(nèi) 5個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)：rs923875、rs2396722、rs1852469、rs17137124 和 rs1456031，對(duì)其等位基因及基因型頻率在我國遼寧地區(qū)漢族人群中的分布情況進(jìn)行了分析，為FOXP2基因相關(guān)疾病的研究提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所需主要試劑：平衡酚購自上海生工生物有限公司；蛋白酶K購自德國MERCK公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs購自Takara公司；限制性內(nèi)切酶 ApalI、AflII、RsaI 及 VspI、Tru1I 分別購自美國NEB公司和MBI公司；DNA Marker DL-2000購自大連寶生物工程有限公司。引物由上海invitrogen公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

實(shí)驗(yàn)所需主要儀器設(shè)備包括TGL-16G臺(tái)式高速離心機(jī)、TP600 型 PCR 擴(kuò)增儀（Takara，Japan）、BG-Power600i電泳儀（BAYGENE公司）、HZS-H 恒溫水浴振蕩器、自動(dòng)凝膠成像及分析系統(tǒng)、QIAQuick PCR purification kit及 ABI 3730 DNA測序儀。

1.3 試驗(yàn)方法

選擇140名無血緣關(guān)系的遼寧地區(qū)健康體檢兒童作為研究對(duì)象，年齡4.5～12歲，均為漢族，既往健康，無遺傳性疾病及神經(jīng)、精神疾病史。

1.3.1 基因組DNA提取 留取受試者外周靜脈血2 mL，經(jīng)EDTA抗凝，分離白細(xì)胞，按照常規(guī)酚-氯仿異戊醇法提取基因組DNA。

1.3.2 PCR擴(kuò)增目的基因片段 采用PCR擴(kuò)增目的基因片段，引物選自參考文獻(xiàn)[4]或采用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)，由invitrogen公司合成。 PCR反應(yīng)總體積為20μL，包括10×緩沖液（2.5 mmol/L plus Mg+）1.25μL，2.5 mmol/L dNTP 1μL，10 pmol上游、下游引物各0.1～0.5μL，DNA模板1～2μL，1～2u Taq聚合酶。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3～4 min，94℃變性 30～40 s、55～61℃退火 40～60 s、72℃延伸 50～60 s、30～35 個(gè)循環(huán)，72℃延伸 7 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠檢測，若目的電泳帶清晰、無雜帶，表明PCR擴(kuò)增成功。各引物序列詳見表1。

表1 各SNPs位點(diǎn)及PCR擴(kuò)增引物序列

1.3.3 PCR-RFLP分析及基因分型 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增成功后選用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切分析，配制20μL酶切反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μL，10×Buffer 2μL，內(nèi)切酶 0.5～0.8μL，加 ddH2O 至20μL。放置于水浴箱中消化3 h。酶切消化結(jié)束后加入10×Loading buffer 2.0μL終止酶切反應(yīng)。將酶切反應(yīng)產(chǎn)物加至2%或2.5%的瓊脂糖凝膠上樣孔中，設(shè)定電壓100 V，在1×TBE溶液中電泳40～60min。電泳結(jié)束后在凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)中成像掃描，記錄各樣本SNPs的等位基因型。各SNPs位點(diǎn)限制性內(nèi)切酶及酶切產(chǎn)物詳見表2。

1.3.4 直接測序 根據(jù)酶切電泳圖隨機(jī)選取不同條帶的樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)SNP位點(diǎn)共選取6個(gè)樣本，PCR反應(yīng)體系50μL，PCR反應(yīng)條件同前，擴(kuò)增成功后進(jìn)行直接測序分析。PCR產(chǎn)物純化應(yīng)用QIAQuick PCR purification kit（Qiagen，Germany）進(jìn)行，在 ABI 3730 DNA 測序儀（Perkin Elmer，F(xiàn)oster city，California，USA）進(jìn)行測序。測序結(jié)果與酶切分析結(jié)果及GeneBank數(shù)據(jù)庫中人類FOXP2基因NC_000007.12序列進(jìn)行比較。

表2 各SNPs位點(diǎn)限制性內(nèi)切酶及酶切產(chǎn)物

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各多態(tài)位點(diǎn)的基因型和等位基因型采用百分率表示，根據(jù)Hardy-Weinberg平衡定律計(jì)算各多態(tài)位點(diǎn)基因型的期望值，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn)。組間等位基因頻率的比較采用χ2檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)處理采用SPSS12.0軟件包，P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。各位點(diǎn)間的遺傳相關(guān)性分析采用連鎖不平衡檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)處理采用在線分析程序SHEsis online program[5]。

2 結(jié)果

2.1 遼寧地區(qū)漢族健康人群FOXP2基因SNP的Hardy-Weinberg定律吻合度檢驗(yàn)

FOXP2基因內(nèi)的 5個(gè) SNPsrs923875、rs2396722、rs1852469、rs17137124 和 rs1456031 在遼寧地區(qū)漢族人群中均有多態(tài)性，其基因型及等位基因頻率分布見表3，經(jīng)Hardy-Weinberg吻合度檢驗(yàn) ，rs923875、rs2396722、rs1852469、rs17137124 和rs1456031位點(diǎn)P＞0.05，表明本研究群體中各位點(diǎn)的頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明樣本具有群體代表性。實(shí)驗(yàn)中，有個(gè)別樣本的FOXP2基因單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)經(jīng)多次PCR或酶切反應(yīng)仍不成功，未能成功分型，其中包括rs2396722位點(diǎn)2例，rs1852469位點(diǎn)3例，rs1456031位點(diǎn)2例。見表3。

2.2 遼寧地區(qū)漢族健康人群與其他人種FOXP2基因SNPs比較

本研究將結(jié)果與其他種族人群的有關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示FOXP2基因5個(gè)多態(tài)位點(diǎn)等位基因分布與西班牙高加索人比較差異均有顯著性。此外，rs923875位點(diǎn)的等位基因頻率與歐洲裔美國人比較也存在明顯差異（P＜0.05），與美國黑人相比沒有明顯差異（P＞0.05）；rs1852469位點(diǎn)的基因頻率與歐洲裔美國人、尼日利亞約魯巴人相比差異顯著（P＜0.05），與日本人相比差異無顯著性（P＞0.05）；rs17137124位點(diǎn)的等位基因頻率與尼日利亞約魯巴人比較有明顯差異（P＜0.05），與歐洲裔美國人、日本人比較差異無顯著性（P＞0.05）。詳見表4。

表3 各SNPs基因型和等位基因頻率及Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn)

表4 遼寧地區(qū)漢族健康人群FOXP2基因多態(tài)分布及與其他人種比較

2.3 遼寧地區(qū)漢族人群FOXP2基因5個(gè)SNPs之間連鎖不平衡檢驗(yàn)

連鎖不平衡分析結(jié)果顯示，遼寧地區(qū)漢族人群FOXP2基因rs2396722與rs923875之間存在中等程度連鎖關(guān)系，rs2396722與rs17137124存在中等程度連鎖關(guān)系，其余各多態(tài)位點(diǎn)間存在較弱的連鎖不平衡。見表5。

表5 140名遼寧地區(qū)漢族人群FOXP2基因多態(tài)性連鎖不平衡分析

DNA測序結(jié)果：測序結(jié)果均與酶切結(jié)果相符，也未發(fā)現(xiàn)其他序列變異。

3 討論

FOXP2基因編碼的FOXP2蛋白包括一個(gè)多谷氨酸鹽束、一個(gè)鋅指、一個(gè)亮氨酸拉鏈基序和一個(gè)叉頭框DNA結(jié)合區(qū)[1，6]，在成人及胎兒腦組織存在高表達(dá)[7]。FOXP2基因所在的染色體7q31缺失或斷裂病例均有嚴(yán)重的語言和言語障礙[8-10]，進(jìn)一步證實(shí)FOXP2基因是重要的言語相關(guān)基因。此外，F(xiàn)OXP2蛋白可以調(diào)控其它基因在發(fā)育中的肺組織、心血管、腸道和神經(jīng)組織的表達(dá)。迄今為止，在人腦包括神經(jīng)軸突、額皮質(zhì)下層已發(fā)現(xiàn)多個(gè)FOXP2基因的靶向基因[11]。SPITERI E[12]的體外研究已經(jīng)證實(shí)FOXP2基因的調(diào)控作用，而且，其中很多FOXP2基因的靶基因?qū)τ谥袠猩窠?jīng)系統(tǒng)發(fā)育如神經(jīng)軸突的生長起到關(guān)鍵性作用。2008年，新英格蘭雜志報(bào)道FOXP2基因可以下調(diào)CNTNAP2基因[13]，CNTNAP2基因編碼突觸前膜外伸蛋白（neurexin），在突觸發(fā)生和突觸傳遞等過程中發(fā)揮重要作用[14]。

SNPs，即單核苷酸多態(tài)性，是1996年由美國麻省理工學(xué)院人類基因組研究中心負(fù)責(zé)人lander提出的一類新型標(biāo)記，是指染色體基因水平上單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，在人群中發(fā)生頻率大于1%。與微衛(wèi)星相比，SNP具有穩(wěn)定性高的特點(diǎn)，從而避免了標(biāo)記的高突變率給人群遺傳分析帶來的困難。此外，位于基因編碼區(qū)和調(diào)控區(qū)的SNP有可能直接影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或者表達(dá)水平。因此，SNPs被廣泛應(yīng)用于疾病易感基因的定位及連鎖和關(guān)聯(lián)分析。然而各多態(tài)位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率在不同種族、不同群體之間均存在很大差異。因此，有必要研究基因多態(tài)性在不同人群的分布特點(diǎn)以便于進(jìn)一步的遺傳分析。

本研究以遼寧地區(qū)漢族人群為研究對(duì)象，對(duì)言語相關(guān)基因 FOXP2的 5個(gè) SNPs：rs923875、rs2396722、rs1852469、rs17137124 和 rs1456031 的基因型及等位基因頻率進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示5個(gè)多態(tài)位點(diǎn)在遼寧地區(qū)漢族人群中均有多態(tài)性，其中rs923875的等位基因A、C的頻率分別為0.368和0.632；rs2396722的等位基因 C、T的頻率分別為0.551和0.449；rs1852469的等位基因A、T的頻率分別為0.464和0.536；rs17137124的等位基因C、T的頻率分別為0.621和0.379；rs1456031的等位基因 C、T的等位基因頻率為 0.547和 0.453。經(jīng)Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn)，5個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律。

筆者同時(shí)對(duì)以上5個(gè)SNPs之間進(jìn)行了配對(duì)連鎖不平衡分析，用D’值表示連鎖不平衡程度。D’值位于0到1之間，一般將D’＜0.3看作較弱的連鎖不平衡，0.3＜D’＜0.7 為中等程度的連鎖不平衡，D’＞0.7為較高程度的連鎖不平衡。本研究結(jié)果顯示，rs2396722與 rs923875，rs2396722與 rs17137124之間存在中等程度的連鎖不平衡，rs2396722與rs923875均位于FOXP2基因5’非翻譯區(qū)，二者之間相距94.4kb，rs2396722與rs17137124相距247.8 kb。其余多態(tài)位點(diǎn)間存在較弱的連鎖不平衡。目前關(guān)于控制連鎖不平衡的各種因素的研究尚處于初級(jí)階段[15]，影響連鎖不平衡的因素較多，其中突變及重組最為研究者所關(guān)注。

筆者對(duì)5個(gè)SNPs的等位基因在不同種族人群中的分布情況進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：遼寧地區(qū)漢族人群FOXP2基因5個(gè)多態(tài)位點(diǎn)等位基因分布與西班牙高加索人比較差異均有顯著性。此外，rs923875位點(diǎn)的等位基因頻率與歐洲裔美國人比較也存在明顯差異（P＜0.05），與美國黑人相比沒有明顯差異（P＞0.05）；rs1852469位點(diǎn)的基因頻率與歐洲裔美國人、尼日利亞約魯巴人相比差異顯著（P＜0.05），與日本人相比無顯著性差異（P＞0.05）；rs17137124位點(diǎn)的等位基因頻率與尼日利亞約魯巴人比較有明顯差異（P＜0.05），與歐洲裔美國人、日本人比較差異無顯著性（P＞0.05）。由于國內(nèi)尚無其他地區(qū)人群FOXP2基因相關(guān)研究數(shù)據(jù)，所以本文未能與國內(nèi)其他地區(qū)或民族進(jìn)行比較。

2004年，GONG氏[16]等選擇 FOXP2基因rs1852469、rs1456031及rs2396753三個(gè)位點(diǎn)對(duì)181個(gè)孤獨(dú)癥家系進(jìn)行傳遞不平衡研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs1456031可能與漢族兒童孤獨(dú)癥有關(guān)。SANJUáN J[17]等研究了149名精神分裂癥患者rs923875的等位基因頻率分布并與137名正常對(duì)照進(jìn)行比較，沒有發(fā)現(xiàn)有意義的陽性結(jié)果。PADOVANI A[18]等對(duì)210例伴有語言障礙的額顳葉變性患者和200名正常對(duì)照進(jìn)行的FOXP2基因 rs2396753、rs1456031、rs17137124及rs1852469四個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的研究中也未發(fā)現(xiàn)基因型和等位基因頻率的差異，但結(jié)果顯示rs1456031TT和rs17137124TT基因型與言語流暢性測驗(yàn)得分相關(guān)。筆者選擇本文研究的5個(gè)多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行了FOXP2基因與功能性構(gòu)音障礙的相關(guān)性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：rs1852469T等位基因可能是決定疾病易感性的重要因素[19]，提示FOXP2基因可能與功能性構(gòu)音障礙相關(guān)。

綜上所述，F(xiàn)OXP2基因的5個(gè)SNPs：rs923875、rs2396722、rs1852469、rs17137124 及 rs1456031 在我國遼寧地區(qū)漢族人群中均有多態(tài)性；與其他種族人群相比，5個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的等位基因頻率在不同種族間存在差異。這將為有關(guān)FOXP2基因的研究及語言障礙相關(guān)疾病的群體研究提供依據(jù)和基礎(chǔ)，這5個(gè)SNPs可以作為遺傳標(biāo)記用于語言言語障礙類疾病的關(guān)聯(lián)分析及連鎖分析。最近，TOLOSA[20]等發(fā)現(xiàn)SNP rs2253478與精神分裂癥的言語障礙有關(guān)。因此，F(xiàn)OXP2基因的其他SNPs的分布特點(diǎn)有待于今后的繼續(xù)研究。

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