許亞麗 胡揚(yáng) 溫輝 任志軍

1 河南大學(xué)體育學(xué)院（開封 475000） 2 北京體育大學(xué)科學(xué)研究中心3 河南省洛陽市中心醫(yī)院神經(jīng)外科 4 廣東省江門市人民醫(yī)院腦血管疾病科

血紅素是人體內(nèi)具有重要功能蛋白質(zhì)如血紅蛋白、肌紅蛋白、線粒體細(xì)胞色素、過氧化物酶、鳥苷酸環(huán)化酶、細(xì)胞色素P450酶等的輔基，在運(yùn)輸和儲(chǔ)備氧氣、電子傳遞及能量生成、抗氧化、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及藥物代謝等方面發(fā)揮重要功能。此外，血紅素還參與珠蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄和翻譯以及紅系分化的調(diào)節(jié)等［1-4］。如果體內(nèi)血紅素合成受限或缺乏，會(huì)導(dǎo)致貧血和白血病，還引起線粒體功能衰退、能量產(chǎn)生障礙和氧化應(yīng)激增強(qiáng)等變化［5］。因此，血紅素代謝與機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力尤其是耐力密切相關(guān)。

亞鐵螯合酶（ferrochelatase，F(xiàn)ECH）是生物體中合成血紅素的最后一個(gè)酶，催化亞鐵離子嵌入原卟啉Ⅸ形成血紅素，主要存在于骨髓、肝臟、血液的網(wǎng)狀細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中.如果FECH缺乏或功能受損，會(huì)導(dǎo)致原卟啉在紅細(xì)胞內(nèi)、肝內(nèi)大量蓄積引發(fā)紅細(xì)胞肝性卟啉病，對(duì)機(jī)體造成極大損害［6-8］。因此，F(xiàn)ECH活性與有氧運(yùn)動(dòng)能力密切相關(guān)。目前，F(xiàn)ECH基因多態(tài)性與運(yùn)動(dòng)能力的關(guān)聯(lián)性研究國內(nèi)外未見報(bào)道。本研究選取位于第3內(nèi)含子中的IVS3-48T/C多態(tài)作為標(biāo)記，觀察該多態(tài)性與VO2max、通氣無氧閾（VT）、跑節(jié)省化（RE）等指標(biāo)初始值和耐力訓(xùn)練敏感性的關(guān)聯(lián)，探尋預(yù)測有氧運(yùn)動(dòng)能力的分子遺傳學(xué)標(biāo)記。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

選取102名中國北方（東北三省、河北、山東等淮河以北平原地區(qū)）漢族健康男性受試者，年齡（18.82±0.88）歲，身高（171.67±5.83）cm，體重（60.27±6.54）kg。均為中國武裝警察某部隊(duì)的新兵（2003年1月入伍，3月參加實(shí)驗(yàn)），且其雙親、祖輩雙親均為漢族，入伍前均無系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練史，體檢合格。實(shí)驗(yàn)取得了所有受試者的知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 有氧耐力訓(xùn)練方案

受試者進(jìn)行18周、每周3次的5000 m勻速跑訓(xùn)練。正式訓(xùn)練前先進(jìn)行2周適應(yīng)性訓(xùn)練。第3周開始進(jìn)行每周3次5000 m勻速跑，訓(xùn)練強(qiáng)度控制為95%個(gè)體通氣無氧閾時(shí)的心率±3次/min。從第12周開始以105%個(gè)體通氣無氧閾時(shí)的心率±3次/min的強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)。心率控制由芬蘭Polar心率表實(shí)施。如因氣候和軍事行動(dòng)等原因而被迫停訓(xùn)，則擇日補(bǔ)訓(xùn)。參加訓(xùn)練的士兵作息時(shí)間一致，飲食條件一致，訓(xùn)練安排一致。同時(shí)，參加訓(xùn)練的士兵不再進(jìn)行額外的2000 m以上的長跑訓(xùn)練，只進(jìn)行一般軍事和力量訓(xùn)練。

1.2.2 VO2max、VT、跑節(jié)省化的測定

VO2max、通氣閾（Ventilatory threshold，VT）、跑節(jié)省化采用聯(lián)合測試方法，在跑臺(tái)（坡度為0）上逐級(jí)遞增運(yùn)動(dòng)負(fù)荷測定。18周訓(xùn)練前后各測定1次，使用德國產(chǎn)固定跑臺(tái)ERICH JAEGER Treadmill E6、德國產(chǎn)氣體代謝分析儀JAEGER oxygen analyer和德國產(chǎn)心電監(jiān)測儀HELLLGE SMS-181進(jìn)行測量。

跑節(jié)省化實(shí)驗(yàn)參照Krahenbuhl的負(fù)荷標(biāo)準(zhǔn)，選取12.0 km/h（33.3 m/s）作為“適宜的極限下負(fù)荷速度”［9］。獲取數(shù)據(jù)為攝氧量絕對(duì)值（VO2）、攝氧量相對(duì)值（rVO2），心率（HR），通氣閾（VT），每分鐘肺通氣量（VE），跑節(jié)省化狀態(tài)下的攝氧量絕對(duì)值（RE/VO2）、攝氧量相對(duì)值（RE/rVO2）、心率（RE/HR）、通氣量（RE/VE）等。具體方法如下：先讓所有受試者試跑3 min，以適應(yīng)跑臺(tái)的運(yùn)動(dòng)方式。第1分鐘：坡度為0，速度逐漸增加到7.5 km/h，受試者從自然走步移行為跑步，保持2 min。第3分鐘：坡度為0，速度增至10.0 km/h，保持2 min。第5分鐘：坡度為0，速度增至12.0 km/h（“適宜的極限下負(fù)荷速度”），保持5 min。利用氣體代謝分析儀實(shí)時(shí)收集呼出氣體，計(jì)算運(yùn)動(dòng)中耗氧量，當(dāng)耗氧量曲線達(dá)到?jīng)]有變化的穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)，即可停止運(yùn)動(dòng)，此狀態(tài)下的VO2即為跑節(jié)省化值［10］。第10分鐘：坡度增加2%，速度增至12.5 km/h。第11分鐘后：坡度每分鐘增加2%，速度每分鐘增加0.5 km/h，視個(gè)人能力逐級(jí)遞增，直至力竭。

VO2max判定標(biāo)準(zhǔn)：（1）連續(xù)兩次吸氧量變化在5%以下或150 ml/min或2 ml/kg/min以下；（2）呼吸商接近1.1；（3）受試者精疲力竭，雖一再鼓勵(lì)也無法跟上跑臺(tái)速度。

通氣閾的判定標(biāo)準(zhǔn)：肺通氣量、二氧化碳呼出量等指標(biāo)急劇增加（或非線性增加）的拐點(diǎn)為通氣閾。

1.2.3 基因多態(tài)性分析

用Promega試劑盒提取全血DNA，PCR擴(kuò)增：（1）使用Primer Premier 5.0軟件自行設(shè)計(jì)引物，上引物：5’-ggc tta atc ttg tta ggc tct-3’，下引物：5’-cct gct tgg aag tcc ata tct-3’，經(jīng)blast比對(duì)后具有很高的特異性（引物由上海生工合成），PCR產(chǎn)物目的片段長度223bp。（2）PCR擴(kuò)增體系（15μl）：10×PCR buffer 2μl，25 mMMgCl21.02 μl，dNTP 2μl，5 μM的上下引物各2 μl，Taq酶0.2 ul（5 U/ul）（上海生工），DNA模板100 ng，雙蒸水補(bǔ)齊至15 μl。（3）PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7分鐘。經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳（100V跑5分鐘，出孔后調(diào)成80V跑30分鐘），熒光染料（Sybgreen，0.5 μg/ml）染色檢測 PCR 產(chǎn)物。（4）限制性片段長度多態(tài)分析：限制性內(nèi)切酶為Sat I，反應(yīng)體系為 8 μl：10×T Buffer 0.7 μl，雙蒸水 2.8μl，Sat I 1 μl（1U），PCR 產(chǎn)物 3.5 μl，37℃水浴 5小時(shí)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以各指標(biāo)訓(xùn)練前后變化率［△＝（訓(xùn)練后－訓(xùn)練前）/ 訓(xùn)練前］表示有氧耐力訓(xùn)練敏感性。應(yīng)用Finetti軟件計(jì)算Hardy-Weinberg平衡；訓(xùn)練前數(shù)據(jù)的正態(tài)分布情況用K-S方法檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布的，基因型之間各生理指標(biāo)的初始值及基因型之間的訓(xùn)練敏感性采用單因素方差分析。不符合正態(tài)分布或方差不齊的，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)處理均采用SPSS11.5軟件包完成，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P < 0.1為有變化趨勢。

2 結(jié)果

2.1 IVS3-48T/C多態(tài)性解析及分布特征

FECH基因IVS3-48T/C多態(tài)位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物經(jīng)Sat I限制性內(nèi)切酶消化后用2%瓊脂糖凝膠電泳（80V跑45分鐘），熒光染料（Sybgreen，0.5 μg/ml）染色后紫外光成像，共得到三種條帶：有酶切位點(diǎn)的純合型有152 bp和71 bp兩條帶（為CC型），沒有酶切位點(diǎn)純合型為223 bp一條帶（為TT型），而雜合型（CT型）有223 bp、184 bp和71 bp三條帶電泳圖及測序圖見圖1、2。

經(jīng)統(tǒng)計(jì)，IVS3-48T/C多態(tài)性在受試者人群中的分布為：CC基因型8人，分布頻率為8%；CT基因型46人，分布頻率為45%；TT基因型48人，分布頻率為47%?；蛐头植挤螲-W平衡（χ2=0.44，df=1，P = 0.51），具有群體代表性。

圖1 FECH基因IVS3-48T/C多態(tài)位點(diǎn)PCR-RFLP瓊脂糖凝膠分型

圖2 FECH基因IVS3-48T/C多態(tài)位點(diǎn)測序圖

2.2 IVS3-48T/C不同基因型有氧耐力訓(xùn)練前后VO2max、VT的比較

表1顯示，訓(xùn)練前，最大攝氧量及通氣閾等指標(biāo)的初始值在各基因型之間均無顯著性差異；訓(xùn)練后，TT、TC基因型VT/VO2均升高，而CC基因型下降，TT基因型增加幅度有高于CC型的趨勢（P< 0.1），其余均無顯著性差異。

2.3 IVS3-48T/C不同基因型有氧耐力訓(xùn)練前后跑節(jié)省化的比較

表2顯示，訓(xùn)練前，CC型RE/HR初始值顯著高于TT型（P < 0.05），有高于CT型的趨勢（P< 0.1）；CC型RE/rVO2初始值均顯著高于TT型和CT型（P < 0.01）；其余指標(biāo)初始值在各基因型間均無顯著性差異。訓(xùn)練后，TT型RE/HR的下降幅度有高于CC型的趨勢（P < 0.1）；TT型RE/VE的下降幅度顯著高于CT型（P < 0.05）；其余指標(biāo)變化率在各基因型間無顯著性差異。

表1 FECH基因IVS3-48T/C不同基因型有氧耐力訓(xùn)練前后VO2max、VT的比較

表2 FECH基因IVS3-48T/C不同基因型有氧耐力訓(xùn)練前后RE的比較

3 討論

有氧運(yùn)動(dòng)能力不但是體能類項(xiàng)目運(yùn)動(dòng)員必備的能力和素質(zhì)，也是提高訓(xùn)練效果和比賽成績的重要保障。有氧運(yùn)動(dòng)能力在很大程度上受遺傳影響［11，12］，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，引起不同人群運(yùn)動(dòng)能力及運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練敏感性的差異與基因多態(tài)性有關(guān)［13］。因此，通過與有氧運(yùn)動(dòng)能力相關(guān)的基因多態(tài)性研究，不僅可將運(yùn)動(dòng)員選材提高到分子水平，而且可以為個(gè)性化耐力訓(xùn)練方案的制定提供分子指標(biāo)，另外還可為全民健身人群制定個(gè)性化運(yùn)動(dòng)處方提供依據(jù)。

本研究選用體育運(yùn)動(dòng)實(shí)踐中常用的經(jīng)典指標(biāo)VO2max、VT、跑節(jié)省化等來評(píng)定有氧運(yùn)動(dòng)能力，并將FECH基因IVS3-48T/C多態(tài)與之進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，18周耐力訓(xùn)練前，CC型RE/HR初始值顯著高于TT型，有高于CT型的趨勢；CC型RE/rVO2初始值均顯著高于TT型和CT型，說明IVS3-48T/C多態(tài)與RE初始水平存在關(guān)聯(lián)，其中TT型具有較高的跑節(jié)省化起始水平。

18周耐力訓(xùn)練后，TT、TC基因型VT/VO2均提高，CC基因型下降，并且TT基因型的增加幅度有高于CC型的趨勢。在跑節(jié)省化測試指標(biāo)中，三種基因型RE相關(guān)指標(biāo)均下降，說明受試者均出現(xiàn)機(jī)能節(jié)省化，但不同基因型間的變化幅度存在明顯不同，其中，TT型RE/VE下降幅度顯著高于CC和TC基因型，表現(xiàn)出較高的訓(xùn)練敏感性。

RE在評(píng)價(jià)有氧運(yùn)動(dòng)能力方面有出色的應(yīng)用價(jià)值，是目前公認(rèn)的描述亞極限負(fù)荷運(yùn)動(dòng)的心肺機(jī)能的最佳指標(biāo)，對(duì)運(yùn)動(dòng)成績的貢獻(xiàn)率高于VO2max，并且，在評(píng)價(jià)有氧耐力訓(xùn)練敏感性方面較VO2max有更明顯的可塑性［14］。RE是受試者在給定的次最大負(fù)荷跑速下運(yùn)動(dòng)時(shí)的氧耗水平。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TT基因型不僅具有較高的跑節(jié)省化起始水平，即較強(qiáng)的有氧運(yùn)動(dòng)能力，并且耐力訓(xùn)練后，出現(xiàn)更顯著的機(jī)能節(jié)省化，即完成相同負(fù)荷的訓(xùn)練時(shí)，所需通氣量較訓(xùn)練前明顯下降。肺通氣與換氣機(jī)能是影響人體吸氧能力的先決因素。有研究表明，人類最大有氧能力的個(gè)體變異76%歸因于遺傳，而通氣敏感度70%歸于遺傳［15］。因此，TT基因型不僅與有氧運(yùn)動(dòng)能力起始水平存在關(guān)聯(lián)，并且與有氧耐力訓(xùn)練敏感性也存在關(guān)聯(lián)。

目前，有關(guān)FECH基因多態(tài)性與運(yùn)動(dòng)能力的研究未見報(bào)道，IVS3-48T/C多態(tài)TT基因型與耐力訓(xùn)練效果存在關(guān)聯(lián)的機(jī)制可能是：FECH為血紅素合成的最后一個(gè)酶，直接決定血紅素的質(zhì)量，而血紅素又是Hb、Mb、線粒體細(xì)胞色素等與氧氣轉(zhuǎn)運(yùn)、氧氣利用及能量產(chǎn)生直接相關(guān)的血紅素類蛋白的輔基，對(duì)心肺功能有直接的影響。該多態(tài)位點(diǎn)位于第3內(nèi)含子中，其中等位基因C（即突變型）可導(dǎo)致異常剪接的mRNA被一個(gè)無意義密碼子介導(dǎo)的降解機(jī)制降解，生產(chǎn)出穩(wěn)定性水平下降的mRNA；并且在內(nèi)含子3-外顯子4序列上游63bp還發(fā)現(xiàn)有一個(gè)隱藏的受體剪接位點(diǎn)，該隱藏剪接位點(diǎn)會(huì)產(chǎn)生出伴有早熟的終止密碼的mRNA，IVS3-48C微基因產(chǎn)生40%的異常剪接mRNA，使其穩(wěn)定性下降。在這兩種機(jī)制的作用下，使不同基因型的FECH活性產(chǎn)生很大不同，三種基因型的酶活性為TT型 >CT型 > CC型［16］。由此影響血紅素代謝途徑，并在通氣功能的訓(xùn)練敏感性上表現(xiàn)不同。但具體機(jī)制有待更深的研究。本課題組將在后續(xù)研究中，通過更多的指標(biāo)評(píng)定體系在分子和基因水平上，更深層次地探討該基因多態(tài)性與有氧運(yùn)動(dòng)能力的關(guān)聯(lián)機(jī)制。

4 總結(jié)

FECH基因IVS3-48T/C多態(tài)性中，TT基因型不僅與有氧耐力起始水平存在關(guān)聯(lián)，還與有氧耐力訓(xùn)練敏感性存在關(guān)聯(lián)，可作為預(yù)測有氧耐力訓(xùn)練敏感性的分子標(biāo)記。

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