陸奕娜

（汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 汕頭 515031）

體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和清除在正常情況下應(yīng)當(dāng)是平衡的。如果由于某些原因，使得體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基過多，或者體內(nèi)防護(hù)、清除和修復(fù)能力下降，體內(nèi)就會(huì)出現(xiàn)氧自由基代謝的失衡，就會(huì)導(dǎo)致自由基損傷，引起疾病的發(fā)生。

大量研究發(fā)現(xiàn)，膳食中富含一些植物化學(xué)物，它們能夠清除自由基，保護(hù)機(jī)體，抵抗疾病。據(jù)文獻(xiàn)[1]報(bào)道大約90%的癌癥都與環(huán)境因素有關(guān)，其中1/3死于癌癥的美國人實(shí)際上可通過改變膳食習(xí)慣而加以避免。正因?yàn)檫@些研究的發(fā)現(xiàn)，使功能性食品和天然健康食品迅速受到消費(fèi)者的關(guān)注，同時(shí)也成為研究與開發(fā)的熱點(diǎn)。

1 抗氧化活性的評(píng)估

現(xiàn)在已經(jīng)建立了許多對(duì)抗氧化活性評(píng)估的體外評(píng)估和體內(nèi)檢測(cè)模型。

1.1 光化學(xué)發(fā)光（Photochemiluminescence，PCL）法

光化學(xué)發(fā)光（PCL）法是使用具有光化學(xué)激發(fā)作用的光敏劑（photoscnsitizer，發(fā)光氨）激發(fā)反應(yīng)分子，使之在紫外燈的作用下以比正常條件下快1000倍的速度發(fā)生氧化反應(yīng)，迅速生成自由基。自由基與樣品中的抗氧化劑發(fā)生反應(yīng)后，用專門的檢測(cè)儀器——超快速抗氧化劑和自由基全自動(dòng)分析儀對(duì)剩余的自由基進(jìn)行測(cè)定，從而檢測(cè)出抗氧化劑的抗氧化能力。該方法能夠快速、準(zhǔn)確、直接、全面地測(cè)定基質(zhì)中的綜合抗氧化能力。

Tsao[2]等選取幾種多酚類抗氧化劑以及植物提取物作為研究對(duì)象，用PCL法檢測(cè)了它們的抗氧化活性，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCL法確實(shí)能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出抗氧化劑的抗氧化活性，并且能夠通過信號(hào)圖直觀地看出幾種物質(zhì)之間抗氧化活性的差異。

由于光化學(xué)發(fā)光法中所用到的分析儀器價(jià)格昂貴，在國內(nèi)應(yīng)用此法對(duì)抗氧化劑的研究鮮有報(bào)道。

1.2 抗氧化劑還原鐵能力（Ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）法

FRAP用來測(cè)量總抗氧化活性。它的原理是通過Fe3＋-TPTZ（Fe3＋-ferric tripyridyl-s-triazine）被樣品中的還原物質(zhì)還原為Fe2＋-TPTZ的形式，該物質(zhì)呈現(xiàn)出藍(lán)色，并在593 nm波長處有最大吸收峰。吸收值越大，說明待測(cè)植物化學(xué)物的抗氧化活性越高。

郭長江等[3]通過FRAP法對(duì)36種蔬菜和30種水果的抗氧化活性進(jìn)行了測(cè)定比較。

1.3 β-胡蘿卜素－亞油酸模型系統(tǒng)（β-CLAMS）

β-CLAMS的原理是在高溫條件下，亞油酸在氧化過程中會(huì)產(chǎn)生過氧化物及游離的自由基，這些過氧化物及游離的自由基會(huì)引起β-胡蘿卜素褪色（該物質(zhì)在490 nm波長中有最大吸收），通過測(cè)定加入的抗氧化劑對(duì)β-胡蘿卜素褪色的抑制情況，可判斷出該抗氧化劑的抗氧化活性的強(qiáng)弱。β-CLAMS就是根據(jù)這個(gè)原理建立起來的一套評(píng)估抗氧化活性的模型系統(tǒng)。

洪慶慈等[4]以β-胡蘿卜素－亞油酸法測(cè)定了8種糧食材料提取物的抗氧化活性，他們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大麥籽和燕麥籽的石油醚提取物都有較高的抗氧化活性，而稻殼和花生殼的石油醚提取物只有微小的抗氧化活性。而8種糧食的甲醇提取物都具有一定的抗氧化活性，其中以花生殼、稻殼和黃豆殼提取物的抗氧化活性比較強(qiáng)。

1.4 氧自由基吸收量（Oxygenradical absorption capacity，ORAC）法

ORAC檢測(cè)法用來檢測(cè)水溶性植物化學(xué)物抗氧化能力的一種方法。該方法以藻紅蛋白（phycoerythrin，PE） 作為指示蛋白，AAPH[2，2’-azobis（2-amidino-propane)dihydrochloride]作為ROO·自由基的發(fā)生物，當(dāng)上述2種化合物混合后，PE在AAPH釋放的ROO·攻擊下，一定波長下的熒光強(qiáng)度不斷衰減，直到降至本底水平，由于不同的抗氧化劑清除自由基的能力各不相同，因此加入上述體系后對(duì)PE的保護(hù)也不同，最后根據(jù)PE熒光強(qiáng)度衰減曲線下面積計(jì)算被測(cè)試樣的抗氧化能力。

郭長江等[5]用ORAC法對(duì)9種堅(jiān)果類食品的抗氧化活性進(jìn)行了測(cè)定，并與FRAP法進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用ORAC法測(cè)定的結(jié)果與FRAP法測(cè)定的結(jié)果差異顯著，但高度相關(guān)（r=0.9754，P<0.01），提出在進(jìn)行抗氧化研究時(shí)應(yīng)注意2種方法的差異。

1.5 Trolox等價(jià)抗氧化劑能力（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）法

該法以ABTS＋[2，2’-azobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate)]為自由基源。由ABTS與亞鐵肌紅蛋白的相互作用或者三價(jià)鐵肌紅蛋白與過氧化氫（H2O2）反應(yīng)產(chǎn)生自由基。通過在734 nm波長處ABTS自由基淬滅后吸收值與Trolox—一種水溶性VE類似物作比較來衡量待測(cè)抗氧化劑的抗氧化能力。

在實(shí)際應(yīng)用中，如采用該種方法則需要較長時(shí)間，而且，ABTS＋會(huì)隨著時(shí)間變化而變化，這樣會(huì)對(duì)測(cè)量結(jié)果造成不利影響。韓光亮等[6]對(duì)ABTS＋法進(jìn)行改良，通過在酶標(biāo)板上以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，測(cè)定抗氧化物質(zhì)對(duì)預(yù)先制備的自由基ABTS＋的清除能力，再用不同濃度的乙醇和重亞硫酸鈉為提取液，在不同的溫度、不同的溶劑/水果比條件下，提取水果黑醋栗（Black curran）中的抗氧化活性物質(zhì)。結(jié)果表明，改良后的ABTS＋法測(cè)定物質(zhì)的抗氧化活性，方法簡便可行，也可用于對(duì)抗氧化物質(zhì)大規(guī)模的篩選。

1.6 二苯代苦味肼基自由基（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）法

DPPH在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，呈紫色，在517 nm有強(qiáng)吸收。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，DPPH的單電子被配對(duì)而使其顏色變淺，在最大吸收波長處的吸光度變小，而這二者呈線性關(guān)系，即抗氧化能力越強(qiáng)吸光度下降值越大。而對(duì)于同種抗氧化劑來說，濃度越大，清除DPPH程度越強(qiáng)。對(duì)于不同的抗氧化劑，可根據(jù)清除50%原始DPPH濃度所需抗氧化劑量（EC50）的大小來比較其抗氧化能力。

豐永紅等[7]用DPPH法測(cè)定了甘蔗制糖過程中各種原料的抗氧化活性，同時(shí)探討了pH、加熱溫度、加熱時(shí)間對(duì)自由基清除率的影響。他們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各種原料均具有較強(qiáng)的抗氧化活性；pH對(duì)抗氧化活性影響很大，而加熱時(shí)間和溫度對(duì)抗氧化活性無顯著影響。初步推斷該活性物質(zhì)屬多酚類化合物。

1.7 硫代巴比妥酸反應(yīng)物值（Thiobarbituricacidreactive substance，TBARS）法

硫代巴比妥酸反應(yīng)物（TBARS）值法是評(píng)價(jià)油脂的氧化程度最常用的方法。氧化的油脂多生成丙二醛，一分子的丙二醛可同兩分子的硫代巴比妥酸作用生成有色化合物，該有色化合物在530 nm左右有吸收。因此，可通過測(cè)定丙二醛的量來評(píng)價(jià)油脂的氧化程度，也可測(cè)定抗氧化劑的活性。

胡博路[8]也用TBARS法測(cè)定了翅堿蓬（suaeda heteroptera）提取物的抗氧化作用。實(shí)驗(yàn)表明，翅堿蓬的水、甲醇、正己烷提取物對(duì)亞油酸脂質(zhì)過氧化均有良好的阻斷作用，其中以正己烷提取物阻斷能力最強(qiáng)。他還用同種方法[9]測(cè)定了核桃殼的抗氧化作用。核桃殼能有效地抑制脂質(zhì)過氧化，其正己烷、乙酸乙酯提取物抑制脂質(zhì)過氧化的效果可與茶多酚相媲美。

1.8 體內(nèi)抗氧化評(píng)價(jià)方法

體內(nèi)抗氧化評(píng)價(jià)方法包括DNA、蛋白質(zhì)以及線粒體氧化損傷檢測(cè)方法[10]。

目前對(duì)DNA氧化損傷的檢測(cè)可分為直接和間接兩方面的檢測(cè)，直接檢測(cè)DNA損傷比較常用的方法是測(cè)量DNA單鏈斷裂，目前廣泛應(yīng)用單細(xì)胞凝膠電泳法（SCGE）。間接檢測(cè)DNA氧化損傷較常用的指標(biāo)是測(cè)定血清與尿中8-羥基脫氧鳥苷。正常情況下，8-羥基脫氧鳥苷在DNA修復(fù)機(jī)制的作用下被及時(shí)切除，形成8-羥基脫氧鳥苷隨尿液排出體外。所以血清與尿中8-OH-dG可作為DNA氧化性損傷的分子生物學(xué)標(biāo)記物。目前有酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法、P后標(biāo)記法、氣質(zhì)聯(lián)用分析法（GC2MS）、PY共振光散射法等[11]。

針對(duì)蛋白質(zhì)的抗氧化保護(hù)檢測(cè)方法都是檢測(cè)抗氧化劑對(duì)蛋白質(zhì)氧化損傷生成的羰基清除作用。蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)分布廣泛，它的氧化損傷對(duì)細(xì)胞生理至關(guān)重要，檢測(cè)時(shí)要加入二硝基苯肼（DNPH），再使用分光光度法或者使用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定蛋白質(zhì)羰基生成，來衡量蛋白質(zhì)的氧化損傷情況。然而蛋白質(zhì)的氧化損傷特異性物質(zhì)可能不是羰基，現(xiàn)在認(rèn)為是3-硝基酪氨酸。目前主要采用免疫組織化學(xué)、高效液相色譜、氣相色譜等。閆莉[12]等通過試驗(yàn)建立了雙抗體夾心ELISA法快速測(cè)定3-硝基酪氨酸，試驗(yàn)平均回收率為100.57%。

粒體的抗氧化活性檢測(cè)可以采用脂質(zhì)過氧化檢測(cè)方法、線粒體腫脹度、線粒體中ATP酶活性等，對(duì)應(yīng)的方法有硫代巴比妥酸（TBA）、分光光度法、定磷法等。實(shí)驗(yàn)中必須精確分離線粒體膜，保證膜功能完整，盡量模擬出在細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。

2 有效成分的提取

天然植物中的成分十分復(fù)雜且有些物質(zhì)含量甚微，提取時(shí)又要求活性因子不能被破壞，溶劑萃取等傳統(tǒng)提取方法已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足對(duì)天然植物進(jìn)行深入研究的需要。如何快速、有效地將活性因子提取出來以及對(duì)提取物進(jìn)一步分離純化成為許多該方面工作者研究重點(diǎn)。

2.1 傳統(tǒng)溶劑提取法

溶劑提取法分為浸提法、溶劑萃取法。根據(jù)提取效果符合相似相溶的原則，浸提法所選用的溶劑應(yīng)該視被提取物的極性強(qiáng)弱而定。溶劑提取法具有應(yīng)用范圍廣、儀器設(shè)備簡單、操作容易等優(yōu)點(diǎn)。

乙醇和水是最為常用的提取溶劑，這是考慮到它們的衛(wèi)生和來源的豐富。因此，極性抗氧化劑如酚酸和許多黃酮的甙類物質(zhì)通常都會(huì)用水、乙醇或者乙醇和水的混合物來提取。張懷珠等[13]采用單因素及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)蕎麥粉中黃酮類化合物的最佳提取工藝進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，在60℃條件下，用15倍的乙醇（65%）浸提3 h，提取效果最佳。

2.2 微波輔助提取法（microwave-assisted extraction，MAE）

MAE是一種利用微波技術(shù)與傳統(tǒng)溶劑提取法相結(jié)合的新的提取技術(shù)，利用不同結(jié)構(gòu)的物質(zhì)在微波場(chǎng)中吸收微波能力的差異,某些組分被選擇性加熱,從而使被提取物質(zhì)從基體或體系中分離。在MAE中，為了使提取溶劑達(dá)到最佳的介電系數(shù)，通常會(huì)加入水或者其它一些極性較大的溶劑來作為改良劑[14]，因?yàn)榫哂懈叩慕殡娤禂?shù)（極性）的溶劑能夠吸收更多的微波能，從而提高提取的效果。主要優(yōu)點(diǎn)是[15]：①可有效保護(hù)功能成分,對(duì)提取物具有較高的選擇性,提取率高。②浸出過程中材料細(xì)粉不凝聚、不糊化。③提取速度快、省時(shí)、溶劑用量少。④安全、節(jié)能、設(shè)備簡單、節(jié)省投資。

郭振庫[16]等用微波提取法提取黃芩中黃芩苷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)微波法提取不僅所需的時(shí)間短，平行性好，而且提取率比超聲波提取法高將近10%。

2.3 超臨界萃取法

處于臨界點(diǎn)附近的超臨界流體對(duì)溶質(zhì)具有獨(dú)特的溶劑優(yōu)點(diǎn)，不僅對(duì)溶質(zhì)具有極高的溶解能力，而且通過改變溫度或壓力就可容易地改變對(duì)溶質(zhì)的溶解度，從而達(dá)到選擇性地萃取、分離化合物。

在食品、香料、化妝品、醫(yī)藥工業(yè)的超臨界流體萃取技術(shù)中，CO2為萃取劑的超臨界萃取顯示了獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，具有溫度與壓力較低、穩(wěn)定性好、無污染、易分離等優(yōu)點(diǎn)。白英[17]等研究了在超臨界狀態(tài)下，不同的萃取壓力、萃取溫度、CO2流量和萃取時(shí)間對(duì)胡蘿卜中β-胡蘿卜素萃取效果的影響。結(jié)果表明：胡蘿卜中β-胡蘿卜素的CO2超臨界適宜萃取條件為：萃取壓力40 MPa，萃取溫度40℃，CO2流量5 L/h，萃取時(shí)間90 min。在此條件下，提取率為6520μg/100 g。4個(gè)因素中，對(duì)提取率影響大小依次為壓力>時(shí)間>溫度>流量，且在最適條件下，超臨界CO2萃取效果均優(yōu)于有機(jī)溶劑。

2.4 超聲提取

超聲波具有3大效應(yīng)：機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng)[18]。機(jī)械效應(yīng)能夠強(qiáng)化介質(zhì)的擴(kuò)散和傳質(zhì)的效果；空化效應(yīng)則會(huì)造成植物細(xì)胞壁及整個(gè)生物體在瞬間破裂，釋放出有效因子；熱效應(yīng)的效果是導(dǎo)致介質(zhì)本身和待萃取成分溫度升高，增大了有效成分的溶解度，并可使被提取成分的生物活性保持不變。此外，超聲波的一些次級(jí)效應(yīng)，如乳化、擴(kuò)散、擊碎等也促進(jìn)了植物中有效成分的溶解、擴(kuò)散和與溶劑的充分混合。超聲提取技術(shù)與常規(guī)溶劑提取法相比，具有不需加熱，耗時(shí)短、提出率高，不影響有效成分的生理活性，適于熱敏性物質(zhì)的提取等優(yōu)點(diǎn)。

王立升等[19]研究小葉榕葉提取黃酮類成分試驗(yàn)，優(yōu)選了工藝參數(shù)：乙醇濃度60%，料液比1∶30，提取時(shí)間20 min，功率為240 W。在該工藝下,小葉榕葉中總黃酮的提取率達(dá)到4.38%，高于傳統(tǒng)熱提取法。

2.5 酶解技術(shù)

大部分植物化學(xué)物往往包裹在細(xì)胞壁內(nèi)，選用適當(dāng)?shù)拿缸饔糜谥参锊牧?，如水解纖維素的纖維素酶、水解果膠質(zhì)的果膠酶等，可以使細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)中的纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)等物質(zhì)降解，破壞細(xì)胞壁的致密構(gòu)造，從而有利于有效因子的溶出。另一方面，通過選擇適當(dāng)?shù)拿割?，可以有效地使目?biāo)物溶出，同時(shí)控制非目標(biāo)物的溶出，在提高溶出效率的同時(shí)，為后續(xù)的提取液的精制創(chuàng)造有利條件。

王敏等[20]介紹了一種對(duì)苦蕎莖葉中黃酮類物質(zhì)的方法——酶水解法，總黃酮得率可達(dá)1.47%，在相同的溫度、pH和處理時(shí)間下，總黃酮得率為未酶解樣品的3.08倍。

2.6 加壓液體萃取法（pressurizedliquid extraction，PLE）

PLE也稱加速溶劑萃取法（accelerated solvent extraction，ASE），PLE是將樣品放在密封容器中，加熱到高于溶劑沸點(diǎn)的溫度（通常50℃～200℃），引起容器中壓力升高，同時(shí)給予一定壓力使溶劑不發(fā)生氣化，從而大大提高萃取速度，實(shí)現(xiàn)了高溫、高壓條件下的萃取。PLE的優(yōu)點(diǎn)在于溶劑用量少，萃取時(shí)間短，回收率、精度與索氏提取相當(dāng)[21]。

PLE在天然植物活性成分提取中的應(yīng)用最早開始于Benthin等的工作[22]，后來，PLE在國外被相繼應(yīng)用于植物中黃連素[23]、人參皂苷[24]的提取。

2.7 雙水相提取法（Aqueoustwo－phaseextraction，ATPE）

雙水相萃取技術(shù)（ATPE）屬于液－液萃取，分離原理是物質(zhì)在雙水相體系中的選擇性分配。該法設(shè)備投資少,操作簡單,無有機(jī)溶劑殘留污染。由于雙水相體系分相快，使用溫度低，容易操作，無污染，提取率高，因此成為黃酮化合物富集分離的一種有效方法。

張春秀等[25]采用雙水相萃取法對(duì)銀杏葉浸出液中黃酮類化合物進(jìn)行萃取，具有萃取溫度低，時(shí)間短，且分相速度快的優(yōu)點(diǎn)，萃取率可達(dá)98.2%，高于溶劑萃取的萃取率。

3 分離純化方法

3.1 常規(guī)色譜法（Conventional chromatography）

紙色譜，填充柱和薄層層析常用于許多抗氧化植物化學(xué)物的分離和純化。然而，由于欠缺良好的分離效果和分辨度，而且在檢測(cè)、定量分析和靈敏度方面都存在著難以優(yōu)化的困難，所以這些常規(guī)色譜技術(shù)，特別是紙色譜法，已經(jīng)不像以前那樣應(yīng)用廣泛了。而填充柱和薄層層析由于其設(shè)備簡單且對(duì)操作技能要求低等特點(diǎn)，在植物化學(xué)物的分離方面的應(yīng)用仍有報(bào)道。

李劍明[26]等對(duì)姜黃抗氧化成分及性能進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)用柱色譜法獲取了3種色素單體并用薄層層析法對(duì)各成分進(jìn)行純度鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過柱色譜法可獲取純度很高的多種色素單體。

3.2 氣相色譜法（Gas chromatography，GC）

氣相色譜法是采用氣體作為流動(dòng)相的一種色譜法，具有分離效能高、選擇性好、靈敏度高、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，適合于分離具有揮發(fā)性且熱穩(wěn)定的抗氧化植物化學(xué)物。可是，大多數(shù)來自于植物中具抗氧化活性的植物化學(xué)物如β-胡蘿卜素、酚酸和黃酮等都是不易揮發(fā)且熱不穩(wěn)定的物質(zhì)。因此，GC在對(duì)植物化學(xué)物分離的應(yīng)用上遠(yuǎn)比不上高效液相色譜法（HPLC）[2]。

3.3 高效液相色譜法（High-performance liquid chromatography，HPLC）

高效液相色譜法是20世紀(jì)70年代急劇發(fā)展起來的一項(xiàng)高效、快速的分離分析技術(shù)。在經(jīng)典的液體柱色譜法的基礎(chǔ)上采用高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測(cè)器，實(shí)現(xiàn)了分析速度快，分離效率高和操作自動(dòng)化。其優(yōu)點(diǎn)除了分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方便等以外，最重要的是樣品不需要經(jīng)過氣化處理，因此不受樣品揮發(fā)性的限制，有利于對(duì)具有難揮發(fā)和熱不穩(wěn)定特點(diǎn)的植物抗氧化劑進(jìn)行分離分析，應(yīng)用相當(dāng)廣泛。

3.3.1 HPLC在類胡蘿卜素抗氧化劑分離中的應(yīng)用

適用于類胡蘿卜素的HPLC分析方法的吸附劑溶劑系統(tǒng)分3類：（1）正相：采用以硅膠為固定相的正相色譜法有利于其順反非對(duì)映體的分離，但卻不利于α－及β－位置異構(gòu)體的分離，而且作為分離柱填料的硅膠還促使類胡蘿卜素的降解，因此逐漸被反相分離方法所取代。（2）反相等度：這種系統(tǒng)的色譜柱常使用結(jié)合有十八碳硅烷的氧化硅作為填充劑。該系統(tǒng)一般能較好地分離維生素A原類胡蘿卜素，但分離葉黃素的效果較差。王強(qiáng)[27]報(bào)道了利用該系統(tǒng)成功地分離了多種類胡蘿卜素。（3）反相梯度：在反相柱上運(yùn)用梯度洗脫能夠成功地分離多種類胡蘿卜素[28]。這種系統(tǒng)能夠分離烴基胡蘿卜素、葉黃素及葉綠素等，還能從類胡蘿卜素母體化合物中分離出順式異構(gòu)體及氧化產(chǎn)物。由于該系統(tǒng)能夠精確地分離各種類胡蘿卜素及其異構(gòu)體，最有希望成為分析類胡蘿卜素的應(yīng)用系統(tǒng)。

3.3.2 HPLC在黃酮類抗氧化劑分離中的應(yīng)用

利用高效液相色譜測(cè)定黃酮類物質(zhì)一般都是用反相柱，柱的長度約為100 mm～300 mm，內(nèi)徑約為4.6 mm。固定相經(jīng)過處理后可提高柱的分離效能，如固定相連接β－環(huán)狀糊精可用來分析鑒定黃烷酮糖苷的對(duì)映體。目前已有不需前處理而直接對(duì)黃烷酮對(duì)映體和非對(duì)映體進(jìn)行分離的文獻(xiàn)報(bào)道[29]。張平安等[30]研究了利用反相HPLC法測(cè)定銀杏葉及其提取物中總黃酮的方法，銀杏葉樣品經(jīng)提取水解處理后使用等度洗脫，反相HPLC分離，根據(jù)保留時(shí)間定性，混合外標(biāo)定量。結(jié)果表明，反相HPLC法的準(zhǔn)確度高，能滿足銀杏葉及其提取物中總黃酮的測(cè)定，具有很廣的實(shí)用性。

3.4 高速逆流色譜法（High-speed counter-current chromatography，HSCCC）

HSCC是20世紀(jì)80年代由美國Ito博士發(fā)明的一種新的逆流色譜技術(shù)。它是基于液－液分配原理，利用螺旋管的方向性與高速行量式運(yùn)動(dòng)相結(jié)合，產(chǎn)生一種獨(dú)特的動(dòng)力學(xué)現(xiàn)象，使兩相溶劑在螺旋管中實(shí)現(xiàn)高效地接觸、混合、分配和傳遞，具有分離效率高、超載能力強(qiáng)、溶劑用量少、無氣相色譜中固體載體的吸附現(xiàn)象，應(yīng)用范圍廣，特別適用于極性化合物的分離。逆流色譜在天然產(chǎn)物分離與制備領(lǐng)域應(yīng)用較多[31]。目前,已成功地開發(fā)出分析型和制備型高速逆流色譜儀[15]。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，HSCCC已在生物堿、黃酮、萜類、木脂素、香豆素等成分的研究中獲得成功。佘佳紅等[32]提出用HSCCC分離分析白果內(nèi)酯的簡便方法。

3.5 超臨界流體色譜法（Supercritical fluid chromatography，SFC）

超臨界流體色譜法（SFC）是利用超臨界流體為流動(dòng)相，具有穿透力強(qiáng)，提取率高，不破壞樣品，不需要回收溶劑的分離分析技術(shù)。更重要的是它既可分離GC不適應(yīng)的高沸點(diǎn)、低揮發(fā)、熱不穩(wěn)定的樣品，又比高效液相色譜HPLC有更快的分離速度和更高的柱效率[31]。SFC已廣泛用于天然抗氧化植物化學(xué)物的提取，并與氣相色譜、紅外、質(zhì)譜等技術(shù)聯(lián)用，形成了更為有效的分離分析技術(shù)。

齊國鵬，趙鎖奇[33]采用SFC法以超臨界CO2作為流動(dòng)相，攜帶劑為乙醇或正己烷，考察了番茄紅素及其氧化產(chǎn)物在C18色譜柱上的保留值的變化規(guī)律，確定了最佳的分離條件，結(jié)果的重復(fù)性和平行性較好。

3.6 膜分離法（Film separation）

膜分離法主要有超濾、微濾、納濾和反滲透等，這種方法操作簡便，不需要加熱，不損壞化合物，提取效果好，超濾裝置可反復(fù)使用。于濤等[34]研究了銀杏葉中黃酮類化合物的提取過程及工藝，使用超濾技術(shù)對(duì)粗提的產(chǎn)品進(jìn)行精制，對(duì)影響超濾的工藝條件進(jìn)行了考察，超濾后產(chǎn)品中黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到33.99%。

3.7 高效毛細(xì)管電泳法（High performance capillary electrophoresis，HPCE）

HPCE產(chǎn)生于20世紀(jì)80年代后期，它是以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù)。在高壓作用下，帶電粒子在毛細(xì)管內(nèi)的溶液中遷移，遷移速度等于電泳和電滲流的矢量和[35]。與常用的HPLC相比，具有分析時(shí)間短、分離效率高、適應(yīng)性廣、檢測(cè)限低、進(jìn)樣量少、溶劑消耗少、自動(dòng)化程度高和運(yùn)轉(zhuǎn)費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，所以已成為目前色譜領(lǐng)域中發(fā)展較快的一個(gè)分支，并且在生命科學(xué)、生物技術(shù)，醫(yī)藥等領(lǐng)域顯示了極好的應(yīng)用前景[31]。

隨著電泳技術(shù)的發(fā)展，以毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）、膠束電場(chǎng)毛細(xì)管電泳（MECC）、毛細(xì)管等速電泳（CITP）、毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）、毛細(xì)管等點(diǎn)聚焦（CIEF）等為代表的HPCE分離模式大大拓展了分離純化的運(yùn)用范圍。Tao[36]等用CZE成功分離了苷草根中的黃酮類化合物。Marek[37]等采用CITP和CZE在線聯(lián)用法分離并測(cè)定了金絲桃類植物的葉或花的甲醇提取物中的蘆丁、異櫟素、櫟素等黃酮類化合物。

4 結(jié)論

近幾年，人們熱衷于對(duì)影響人體健康的諸多因素進(jìn)行研究，自由基與抗氧化劑更是其中的熱點(diǎn)。隨著對(duì)自由基作用機(jī)理以及對(duì)人體健康影響的不斷深入了解，人們開始了尋找對(duì)抗自由基的有力武器——抗氧化劑的征程，從VC、VE、人工合成抗氧化劑BHA和BHT，到從天然產(chǎn)物中提取分離具有抗氧化性的植物化學(xué)物，如多酚類和類胡蘿卜素類等。天然抗氧化植物化學(xué)物來源廣，副作用小，其“藥食同源”的優(yōu)勢(shì)符合現(xiàn)代營養(yǎng)免疫學(xué)理念，具有無限的開發(fā)前景和廣闊的需求市場(chǎng)。本文嘗試通過植物化學(xué)物抗氧化活性的評(píng)估、提取和分離3個(gè)方面來介紹近年來對(duì)植物化學(xué)物的研究進(jìn)展，涵蓋了各種方法的優(yōu)勢(shì)、應(yīng)用以及所取得的成果，希望給從事這方面研究的讀者提供一些參考。隨著植物化學(xué)物抗氧化活性的評(píng)估、提取和分離技術(shù)的進(jìn)一步開發(fā)并規(guī)模化，人們的健康水平有望提升至一個(gè)更高的水平。

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