王慧玲 張曉霞 韓美艷 李婷婷 劉 偉

(1.鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學院，河南 鄭州 450052;

2.鄭州大學藥學院，河南 鄭州 450000)

桔梗(Platycodon grandiflorum A.DC)為桔?？贫嗄晟荼局参铮幱闷涓?，春、秋二季采挖，洗凈，除去須根，趁鮮剝?nèi)ネ馄せ虿蝗ネ馄ぃ稍?。我國最早的一部藥書《神農(nóng)本草經(jīng)》已有記載，系常用中藥。桔梗性味苦、辛、平，歸肺經(jīng)，具有宣肺，利咽，祛痰，排膿之功效。用于咳嗽痰多、胸悶不暢、咽痛、音啞、肺癰吐膿、瘡瘍膿成不潰等癥［1］。桔梗根中含有大量由果糖組成的桔梗聚糖，此外，桔梗中還含有大量的菊糖［2］?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)桔梗多糖具有很好的抗腫瘤和增強機體免疫活性的作用［3－4］，而多糖的含量直接影響其藥效的發(fā)揮，但是目前國內(nèi)外對多糖含量的研究基本上測定的都只是總糖的含量而非總多糖的含量［5－6］。因此本文擬通過以桔梗為模型，研究簡單且準確的多糖含量測定的方法，為以后桔梗多糖的進一步研究與應用提供參考和依據(jù)。

1 實驗材料、試劑及儀器

1.1 實驗材料

桔梗:產(chǎn)地是安徽亳州，經(jīng)鄭州大學生藥系潘成學老師鑒定為Platycodon grandiflorum A.DC。

1.2 實驗試劑

3，5－二硝基水楊酸(化學純)，G －25(臺州市路橋四甲生化塑料廠)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 實驗儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE－52AA(上海亞榮生化儀器廠)，臺式高速離心機TDL－5－A(上海安亭科學儀器廠)，分析天平AR1140(梅特勒－托利多儀器上海有限公司)，SHZ－D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)，紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 桔梗多糖的提取

桔梗粉末→石油醚脫脂(60～90℃)→80%乙醇回流提取→熱水浸提→趁熱過濾→殘渣重復提取三次→合并提取液→減壓濃縮→Sevag法除蛋白(多糖濃縮液:氯仿:正丁醇=25:5:1)→無水乙醇沉淀(含醇量達80%)→靜置過夜→抽濾→無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌沉淀→桔梗多糖。

2.2 多糖換算因子的測定

精確稱取干燥至恒重的桔梗精制多糖20mg，置于100ml容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得桔梗多糖貯備液。吸取0.4ml貯備液置25ml具塞試管中，按總糖標準曲線制作方法中“加蒸餾水至2ml”起操作。測定其吸光度，由回歸方程求出此精制桔梗多糖貯備液中葡萄糖質(zhì)量濃度，平行測定6次。按下式計算換算因子f:

f=W/(C×D)

式中:W為稱取多糖的質(zhì)量(mg)，C為精制桔梗多糖貯備液中葡萄糖質(zhì)量濃度(mg/ml)，D為多糖的稀釋倍數(shù)。測得f=1.3127。

2.3 桔梗多糖含量測定

2.3.1 總糖的含量測定

2.3.1.1 蒽酮試劑的配制

稱取0.1g蒽酮，加入50ml濃硫酸攪拌溶解，放置暗處，此試劑需臨用新配。

2.3.1.2 蒽酮硫酸法測總糖的標準曲線制作

稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖10mg，于100ml容量瓶中溶解并定容至刻度，即得到濃度為0.1mg/ml的標準葡萄糖溶液。

精密吸取0.1mg/ml的葡萄糖標準液 0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2ml分別置于干燥具塞試管中，分別加入蒸餾水至2ml，搖勻，于冰浴中小心自管壁加入蒽酮試劑5ml，加塞，混勻，保持混合物冷卻，沸水浴中加熱10min，取出冷卻，以蒸餾水作空白(即0號管)，于620nm波長處測定吸光度，以濃度(μg/ml)為橫坐標，吸光度為縱坐標建立標準曲線，得到回歸方程為A=0.0126C+0.0064(R2=0.9994)。

2.3.1.3 桔?？偺呛繙y定

稱取干燥粗多糖10mg，加水溶解后轉(zhuǎn)至100ml容量瓶中稀釋至刻度。吸取0.8ml，置干燥具塞試管中，按照“2.3.1.2”中標準曲線繪制方法操作，平行測定3次，并按下式計算總糖含量(以葡萄糖計):總糖含量(%)=CD/W×100%。式中:C為樣品溶液的葡萄糖的濃度(μg/ml)，D為樣品溶液的稀釋因子，W為稱取的干燥粗多糖的重量(μg)，測得總糖含量為76.56%。

2.3.2 桔梗多糖中還原糖的含量測定

2.3.2.1 3，5 二硝基水楊酸法(DNS 法)

2.3.2.1.1 DNS 試劑的配制

將6.3g的3，5－二硝基水楊酸和262ml 2mol/L NaOH溶液加到500ml含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g的苯酚和5g亞硫酸鈉攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1000ml，貯于棕色瓶中備用。

2.3.2.1.2 DNS 法測還原糖的標準曲線繪制

稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖 100mg，于100ml容量瓶中溶解并定容至刻度，即得到濃度為1mg/ml的標準葡萄糖溶液。

精密吸取 1mg/ml的葡萄糖標準液 0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2ml分別置于 25ml具塞試管中，加蒸餾水使成2ml，搖勻，各加DNS試劑1.5ml搖勻，置沸水浴中加熱5min，取出冷卻至室溫，用蒸餾水定容至25ml，加塞后搖勻，以蒸餾水作空白(即0號管)，于540nm波長處測定吸光度，以濃度(mg/ml)為橫坐標，吸光度為縱坐標建立標準曲線。得到回歸方程 A=0.988C －0.0191(R2=0.9998)。

2.3.2.1.3 DNS 法測樣品還原糖含量

取干燥樣品1g，加水溶解后轉(zhuǎn)至100ml容量瓶中稀釋至刻度。按“2.3.2.1.2”標準曲線制備項下的方法操作，平行測定3次。還原糖含量計算公式同“2.3.1.3”中總糖含量計算公式，測得還原糖含量為5.75%(以葡萄糖計)。

2.3.2.2 間接碘量法

2.3.2.2.1 碘量法測還原糖的標準曲線繪制

精密稱取105℃下干燥至恒重的葡萄糖1g，溶解于水，在100ml容量瓶中稀釋至刻度，得到10mg/ml的葡萄糖溶液。

分別精密量取0.5，1.0，2.0，3.0，4.0ml的上述葡萄糖溶液至250ml碘量瓶中，補加水至50ml，各加入5ml I2溶液，15ml 0.1mol/L的NaOH溶液，搖勻，放置暗處15min，取出，加入4ml 0.5mol/L HCL搖勻。用0.1mol/L的Na2S2O3滴定至淺黃色，加入0.5%的淀粉指示劑，續(xù)滴至黃色消失。記錄消耗的Na2S2O3體積。以空白與樣品所耗硫代硫酸鈉溶液毫升數(shù)之差為縱坐標，葡萄糖毫克數(shù)為橫坐標作線性回歸。得到回歸方程為 y=0.1102x －0.2361(R2=1)。

2.3.2.2.2 碘量法測樣品還原糖含量

取干燥樣品2.5g，加水溶解后轉(zhuǎn)至250ml容量瓶中稀釋至刻度。取50ml樣品液置250ml碘量瓶中，按標準曲線繪制的方法，自“各加入5ml I2溶液”起，依法測定，平行測定3次。以空白與樣品液所耗的硫代硫酸鈉溶液毫升數(shù)之差，帶入葡萄糖回歸方程中，計算相應的葡萄糖毫克數(shù)。測得還原糖含量為2.65%(以葡萄糖計)。

2.3.3 多糖的含量測定結(jié)果

2.3.3.1 DNS 法

多糖含量=(總糖含量－還原糖含量)×f×100%=70.81%

2.3.3.2 間接碘量法

多糖含量=(總糖含量－還原糖含量)×f×100%=73.91%2.4 驗證實驗

凝膠層析是一類利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠的層析技術(shù)，根據(jù)小分子物質(zhì)可以進入凝膠篩孔中，而大分子物質(zhì)被排阻在其外的原理［5］，使不同分子量的物質(zhì)可以分開。因此可應用凝膠層析法脫去粗多糖中的小分子糖類，從而使大分子多糖能與小分子糖分開。

2.4.1 上樣與洗脫

取藍色葡聚糖2000和β－環(huán)糊精各2mg上樣。以蒸餾水洗脫，流速0.5ml/min，每10min收集一管，用蒽酮－硫酸法跟蹤檢測，以測出該凝膠柱的外水體積和小分子的洗脫體積。然后將多糖溶液上樣，以蒸餾水洗脫，流速0.5ml/min。

2.4.2 含量測定

2.4.2.1 還原糖含量測定

合并小分子糖的洗脫液(以β－環(huán)糊精開始流出時收集)，精密吸取洗脫液2ml，按照DNS法測還原糖的標準曲線繪制方法操作，平行測定3次，測得還原糖的含量為2.72%(以葡萄糖計)。

2.4.2.2 總糖的含量測定

合并全部的洗脫液，精密吸取洗脫液1ml于10ml容量瓶中定容，然后吸取 0.6ml，按照“2.3.1.2”中標準曲線繪制方法操作，平行測定3次，測得總糖含量為73.82%(以葡萄糖計)。

2.4.2.3 多糖含量測定結(jié)果

多糖含量=(總糖含量－單糖含量)×f×100%=71.10%

通過葡聚糖凝膠層析法測得多糖的含量與前面三種方法測得的多糖含量基本一致。

3 討論

苯酚－硫酸法和蒽酮－硫酸法測定的是樣品中總糖的含量，不能排除還原性雜質(zhì)(包括還原糖性的單糖)的干擾，因此本文用之于總糖的測定。苯酚－硫酸法中苯酚極易被空氣氧化，這給重蒸餾帶來困難，而且苯酚本身有毒，操作不便。蒽酮－硫酸法存在顯色劑極易氧化而影響比色的問題，可通過現(xiàn)用現(xiàn)配的方法來解決。相比苯酚－硫酸法，蒽酮－硫酸法適用于少量樣品測定，操作方便，本文選用后者。

間接碘量法在滴定的過程中，剩余碘會不可避免地揮發(fā)，導致滴定誤差。同時，滴定要求在短時間內(nèi)完成，加大了操作難度以及終點的判斷延后。試劑昂貴也是此法的一個缺點。

DNS法試劑穩(wěn)定性高，可在相對較長時間內(nèi)使用，操作方便。

綜合實驗成本、設(shè)備、操作及影響測定因素等方面考慮，選用蒽酮－硫酸法與DNS法相結(jié)合測定桔梗多糖的含量。該法重復性好，靈敏度高，而且該法省去了過柱子的繁瑣，節(jié)約了時間。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2005年版一部［Z］.北京:化學工業(yè)出版社，2005.

［2］吳梅青，劉佳佳.桔?；瘜W成分研究進展［J］.黑龍江醫(yī)藥，2007，20(5):443 －446.

［3］Yoon YD，Kang J S，Han S B，et al.Activation of mitogen －activated protein kinases and AP－1 by polysaccharide isolated from the radix of Platycodon grandiflorumin RAW264.7cells［J］.Int Immunopharmacol，2004，4(8):1477 －1487.

［4］Han S B，Park S H，Lee K H，et al.Polysaccharide isolated from the radix of Platycodon grandiflorum selectively activates B cellsand macrophagesbutnotT cells［J］.Int Immunopharmacol，2001，1(11):1969 －1978.

［5］張蓮姬，南昌希，張麗霞.桔梗多糖的提取及其抗氧化作用研究［J］.食品與機械，2008，24(03):60 －63.

［6］李妍，魏建和，許旭東，等.苯酚硫酸法定量測定桔梗多糖的研究［J］.時珍國醫(yī)國藥雜志，2009，20(01):5 －7.

［7］楊安鋼，毛積芳，等.生物化學與分子生物學實驗技術(shù)［M］.北京:高等教育出版社，第一版，2002.