鄧秀玲 劉淑萍 王棟

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人們的生命，它的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞異常增殖和分化有關(guān)，如何抑制腫瘤細(xì)胞的無限增殖能力，是腫瘤治療的一個基本問題。本實驗探討蒙藥巴特爾-7對胃癌細(xì)胞生長的影響，為抗腫瘤蒙藥的進(jìn)一步開發(fā)提供一些理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 培養(yǎng)基DMEM為Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所生產(chǎn)，噻唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)均為Sigama公司產(chǎn)品。蒙成藥巴特爾-7(以下簡稱蒙藥)、由內(nèi)蒙古中蒙醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，用PBS配成50 mg/ml貯液，0.2 mm濾膜過濾除菌4℃保存，實驗時用培養(yǎng)液稀釋到所需濃度。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) MGC-803細(xì)胞由北京腫瘤研究所提供，于含慶大霉素80U/ml、10%滅活胎牛血清的DMEM的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，置37℃、5%CO2溫箱中孵育，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.3 蒙藥對胃癌MGC-803的細(xì)胞殺傷作用：采用噻唑藍(lán)比色法(MTT法)，取對數(shù)生長期的MGC-803細(xì)胞，經(jīng)消化液消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104個/ml接種96孔培養(yǎng)板，吹打均勻，每孔接種細(xì)胞懸液100 μl，置37℃、5%CO2溫箱中孵育。24 h后實驗組分別加入不同濃度的蒙藥，終濃度分別為 2.5、1.25、0.63、0.31、0.15 mg/ml。另設(shè)陰性對照組(只有細(xì)胞，不加藥)，空白對照組(只含等量培養(yǎng)基，無細(xì)胞和藥)。各處理組設(shè)8個復(fù)孔。以上各處理組總體積均為200 ul。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，每孔加入20 ulMTT(5mg/ml)37℃溫育4 h，離心棄上清后每孔加200 ulDMSO，振蕩10 min。選擇570 nm波長，酶標(biāo)儀上檢測各復(fù)孔吸光度(A值)。進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計時，每組去除一個最大值和最小值，按下列公式計算細(xì)胞生長抑制率。

抑制率%=(對照組平均A值-實驗組平均A值)/(對照組平均A值-空白組平均A值)×100%

1.4 細(xì)胞形態(tài)變化觀察 ①倒置光顯微鏡觀察：將MGC-803細(xì)胞以6×105個/ml接種于75 ml培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h，更換培養(yǎng)液，對照組細(xì)胞用DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，實驗組細(xì)胞加入含蒙藥的培養(yǎng)基，培養(yǎng)后每6 h觀察細(xì)胞形態(tài)變化。②熒光雙染檢測細(xì)胞核形態(tài)變化：收集蒙藥處理24、36、48 h的細(xì)胞，離心、洗滌后制成細(xì)胞懸液，hochest33342和PI熒光染色、洗滌后滴片，于熒光顯微鏡(日本Nikon)下觀察。

1.5 瓊脂糖凝膠電泳檢測 收集2.5 mg/ml不同時間處理組細(xì)胞1.8×106個，按文獻(xiàn)1方法提取DNA。取DNA樣品20 ul與上樣緩沖液按6∶1混勻，上樣于凝膠樣品孔中，于0.5 TBE電泳緩沖液中進(jìn)行電泳，55 V，2～3 h。

2 結(jié)果

2.1 蒙藥對MGC-803細(xì)胞殺傷作用 從表1可見，巴特爾-7能顯著抑制細(xì)胞的生長，與陰性對照組比較具有顯著性差異(P＜0.05)。且隨著藥物劑量增加，抑制率逐漸增高。計算半數(shù)抑制濃度(IC50)1mg/ml。

表1 蒙藥對胃癌MGC-803細(xì)胞的生長影響

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 倒置光鏡下見，對照組細(xì)胞呈不規(guī)則多角形生長，細(xì)胞均質(zhì)而透明，生長旺盛。低濃度巴特爾-7處理24 h后既有少數(shù)細(xì)胞開始變圓，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞增殖速度減慢。2.5 mg/ml藥物作用24 h后部分細(xì)胞已變圓，體積變小，細(xì)胞表面變得粗糙，出現(xiàn)“吐泡”現(xiàn)象，形似梅花狀改變，呈現(xiàn)出凋亡細(xì)胞的形態(tài)改變。隨著作用時間延長，細(xì)胞亮度明顯下降，凋亡細(xì)胞數(shù)目逐漸增加。熒光雙染后，可見對照組細(xì)胞核均勻一致，被Hoechst/33342染成藍(lán)色熒光。2.5 mg/ml藥物作用48 h細(xì)胞核染色質(zhì)凝集、碎裂、凋亡小體形成。

2.3 DNA電泳檢測 對照組在距點樣孔附近有一條亮帶，2.5 mg/ml娜仁處理細(xì)胞24 h電泳時隱約可見“梯狀帶”，36 h、48 h處理組未見梯狀帶的出現(xiàn)。

3 討論

蒙醫(yī)藥是蒙古民族特有的醫(yī)藥，蒙醫(yī)以經(jīng)驗醫(yī)學(xué)為主，積累了許多經(jīng)驗方用于治療各種腫瘤，并取得了一定的療效［2，3，4］。本實驗將巴特爾-7作用于體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其可明顯抑制胃癌細(xì)胞的生長，且呈現(xiàn)劑量依賴性的細(xì)胞毒作用。這與一些復(fù)方中藥［5-7］體外抗腫瘤的細(xì)胞毒作用相似。在倒置光顯微鏡下觀察，藥物作用后部分細(xì)胞皺縮、體積變小，細(xì)胞出現(xiàn)“吐泡”現(xiàn)象，呈現(xiàn)凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。為進(jìn)一步證實倒置光顯微鏡下的觀察結(jié)果，我們采用Hoechst3342/PI雙重染色，來觀察細(xì)胞核的變化，也顯示了凋亡細(xì)胞的改變。提示該蒙藥可能具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

自1980年Wyllie［8］把內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶降解DNA產(chǎn)生的“梯形帶”與細(xì)胞凋亡相聯(lián)系，DNA的ladder帶一直被認(rèn)為是鑒定細(xì)胞凋亡的重要生化標(biāo)志。本實驗DNA電泳沒有出現(xiàn)典型的凋亡“梯形帶”，巴特爾-7作用24 h電泳隱約可見“梯形帶”。其他時間組未見“梯形帶”，但也沒有壞死細(xì)胞DNA涂抹狀的拖帶現(xiàn)象。提示巴特爾-7作用方式較溫和，可能在早些時候DNA被降解成大的片段。有學(xué)者認(rèn)為大片段的形成可能發(fā)生在細(xì)胞凋亡早期，寡核甘酸片段則出現(xiàn)于凋亡晚期，但有些研究則認(rèn)為，在凋亡晚期不一定出現(xiàn)小片段。趙小英等［9］在研究紫杉醇對K562細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用中也觀察到此現(xiàn)象的發(fā)生。譚宇蕙等［10］報道小糵堿對人胃癌MGC-803細(xì)胞生長抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用實驗中也出現(xiàn)本結(jié)果。本實驗結(jié)果表明巴特爾-7可抑制體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞的生長，這種抑制作用是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡還是通過其他機制實現(xiàn)的尚需進(jìn)一步研究。

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