王偉斌

隨著高齡人口和腦卒中存活率的增高，血管性癡呆(VD)的發(fā)病愈來(lái)愈多。由于生理濃度的鈣離子作為神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)第二信使，參與了學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程;因此，神經(jīng)細(xì)胞［Ca2+］i研究一直倍受人們關(guān)注。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型制備與分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用2月齡雄性昆明小鼠。采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎再灌注的方式制備VD模型;假手術(shù)組僅暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈;治療組先制備模型，術(shù)后第2天給予石杉?jí)A甲0.05 μg/g/d 30 d。

1.2 學(xué)習(xí)、記憶成績(jī)測(cè)試 跳臺(tái)試驗(yàn)裝置為被動(dòng)回避反應(yīng)箱，術(shù)后第29天測(cè)試學(xué)習(xí)成績(jī)，記錄動(dòng)物反應(yīng)時(shí)間、錯(cuò)誤次數(shù);24 h后測(cè)試記憶成績(jī)(潛伏時(shí)間及錯(cuò)誤次數(shù))。

1.3 LSCM下觀察神經(jīng)細(xì)胞靜息態(tài)［Ca2+］i及其去極化興奮時(shí)的鈣震蕩 將小鼠斷頭處死，在低溫下分離出海馬組織，制備海馬活細(xì)胞。滴加熒光探針Fluo-3(濃度1000 mM)1 μl，在Bio-Rad MRC-1024型LSCM下，對(duì)錐體細(xì)胞進(jìn)行激光掃描觀察，數(shù)據(jù)為細(xì)胞內(nèi)熒光像素的相對(duì)值;觀察靜息態(tài)［Ca2+］i后，加入20 μl 50 mmol/L氯化鉀溶液，觀察神經(jīng)細(xì)胞的鈣震蕩變化，記錄其［Ca2+］i的上升時(shí)間、下降時(shí)間以及升高的峰值和幅度。

1.4 數(shù)據(jù)分析 采用單因素方差分析，運(yùn)用SAS軟件進(jìn)行處理，并采用SNK法進(jìn)行3組之間的兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 跳臺(tái)試驗(yàn) 表1可見(jiàn)，模型組的學(xué)習(xí)成績(jī)和記憶成績(jī)均劣于假手術(shù)組，治療組的學(xué)習(xí)成績(jī)和記憶成績(jī)均優(yōu)于模型組。

2.2 海馬神經(jīng)細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)變化 表2可見(jiàn)，模型組靜息態(tài)［Ca2+］i顯著高于假手術(shù)組、治療組，并且去極化后海馬神經(jīng)細(xì)胞［Ca2+］i升高幅度明顯降低，恢復(fù)時(shí)間明顯延長(zhǎng)。

表1 各組小鼠學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)比較

表2 海馬神經(jīng)細(xì)胞［Ca2+］i熒光像素相對(duì)值比較

2 討論

VD是因腦血管疾病所致的認(rèn)知功能障礙綜合征。近幾年來(lái)，對(duì)其發(fā)病機(jī)制及治療的研究愈來(lái)愈多。本實(shí)驗(yàn)采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈線(xiàn)結(jié)法造成腦組織反復(fù)缺血-再灌注損傷，并且經(jīng)行為學(xué)測(cè)試存在學(xué)習(xí)和記憶功能障礙，是比較理想的血管性癡呆動(dòng)物模型。

VD小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)失衡，表現(xiàn)為：靜息態(tài)［Ca2+］i升高，去極化時(shí)升高幅度降低、恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)。與小鼠學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)降低相一致，可能參與了VD的分子生物學(xué)發(fā)病機(jī)制。靜息態(tài)［Ca2+］i升高可以促進(jìn)神經(jīng)元凋亡或遲發(fā)性壞死，進(jìn)而降低了海馬參與學(xué)習(xí)和記憶的功能［1］。同時(shí)，海馬神經(jīng)細(xì)胞靜息態(tài)［Ca2+］i過(guò)高可能升高了突觸傳遞的閾值，易化突觸的抑制，降低突觸傳導(dǎo)、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，從而導(dǎo)致了學(xué)習(xí)記憶功能障礙。去極化時(shí)［Ca2+］i升高幅度降低反映了Ca2+內(nèi)流減少，降低了突觸后神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+引起的激酶激活及參與學(xué)習(xí)和記憶的基因轉(zhuǎn)錄，降低了神經(jīng)遞質(zhì)和突觸素的合成，導(dǎo)致LTP的誘導(dǎo)和維持障礙，出現(xiàn)學(xué)習(xí)和記憶功能受損［2］。并且，VD小鼠海馬神經(jīng)元受刺激后，［Ca2+］i持續(xù)升高，恢復(fù)到靜息態(tài)水平的時(shí)間較長(zhǎng)，從而使細(xì)胞凋亡基因的啟動(dòng)、突觸傳遞的閾值升高、鈣依賴(lài)性激酶的激活減少等進(jìn)一步加重。至于石杉?jí)A甲改善VD海馬神經(jīng)細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)的機(jī)理尚在探討中。有學(xué)者研究，石杉?jí)A甲具有神經(jīng)細(xì)胞NMDA受體拮抗作用，并且這種作用與其膽堿酯酶抑制作用無(wú)關(guān)系;其與非競(jìng)爭(zhēng)性NMDA受體拮抗劑MK-801的作用沒(méi)有明顯差別［3］。Gordon等進(jìn)一步研究，石杉?jí)A甲通過(guò)NMDA受體拮抗作用減輕興奮性氨基酸的毒性及繼發(fā)的Ca2+內(nèi)流，從而減輕缺血缺氧引起的神經(jīng)元變性、壞死;這種作用對(duì)M型或N型乙酰膽堿受體及腺苷受體無(wú)影響［4］。

因此，我們認(rèn)為：在石杉?jí)A甲的治療作用下，VD海馬神經(jīng)細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)受缺血缺氧影響不明顯，從而可以維持鈣穩(wěn)態(tài)于正常水平，使神經(jīng)細(xì)胞及其生理功能免于損傷。

［1］Saski C，Kitagawa H.Temporal profile of cytochrome C and caspase-3 immunoreactives and TUNEL staining after permanent middle cerebral artery occlusion in rats.Neurol Res，2000，22(2)：223-228．

［2］徐虹．韓太真與長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)相關(guān)的基因表達(dá)的研究進(jìn)展生理科學(xué)進(jìn)展，2001，32(2)：174-176．

［3］hang YH，Chen XQ.Similar potency of the enantiomers of huperzine A in inhibition of［(3)H］dizocilpine(MK-801)binding in rat cerebral cortex.NeurosciLett，2000，295(3)：116-118．

［4］gordon RK，Nigam SV.The NMDA receptor ion channel：a site for binding of Huperzine A.J ApplToxicol，2001，21(Suppl 1)：47-51．