苗波，劉宇，劉杰，唐海波，徐雷，文晶

(1.佳木斯大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002;2.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

頜面部的皮膚缺損的修復(fù)是口腔頜面外科臨床常見的問題之一，對創(chuàng)面覆蓋物的研究表明，如果缺乏真皮成分的支持和調(diào)控，來自創(chuàng)面的基底的成纖維細(xì)胞將合成不成熟的基質(zhì)，最終成為瘢痕而取代缺乏的真皮，造成創(chuàng)面愈合后質(zhì)量較差［1－2］。異種真皮修復(fù)粘膜缺損已在臨床上廣泛應(yīng)用，但是很少將其用在皮膚缺損的修復(fù)上，主要原因在于皮膚缺損修復(fù)后很難早期建立血供，因而皮片不易成活，而川芎嗪治療大鼠缺血皮瓣及促進(jìn)局部組織微循環(huán)均已得到證實［3－4］。本研究旨在觀察鹽酸川芎嗪注射液用于豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)支架(porcine acellular dermal matrix，PADM)材料修復(fù)大鼠皮膚缺損后的效果和反應(yīng)，探討此種藥物對PADM修復(fù)大鼠皮膚缺損的影響，為臨床提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

豬脫細(xì)胞真皮PADM(第四軍醫(yī)大學(xué)提供);36只SD大鼠，體質(zhì)量在150～200g之間(佳木斯大學(xué)動物中心提供);鹽酸川芎嗪注射液;TRIZOL試劑盒(大連寶生物有限公司);RNA PCR KIT(AWV)VER.3.0試劑盒(大連寶生物有限公司)。

1.2 實驗分組

36只SD大鼠，隨機(jī)分為3組，實驗組采用PADM+自體刃厚皮片移植，并每日腹腔注射(150mg/kg)鹽酸川芎嗪注射液5ml(6周)［5］;對照組采用PADM+自體刃厚皮片移植組，并每日腹腔注射5ml生理鹽水;空白組采用單純自體刃厚皮片移植，并每日腹腔注射5ml生理鹽水。

1.3 手術(shù)及處死

實驗組及對照組是將大鼠用水合氯醛腹腔麻醉后，電推備皮，3%稀碘伏消毒大鼠背部3次，鋪無菌巾，在背部取下2cm×3cm全厚皮，用鼓式取皮機(jī)將全厚皮制備成自體刃厚皮片，厚度為0.2～0.3mm，將自體刃厚皮片覆蓋于PADM上，并同期植入創(chuàng)面，荷包縫合，碘仿油紗加壓固定，2周后拆線。此后在14天，21天，30天，45天每組分別隨機(jī)抽取3只SD大鼠處死，并大體觀察植皮區(qū)創(chuàng)面愈合情況及彈性等。

1.4 標(biāo)本的制取及大體觀察

大鼠處死后，取下置入的材料和組織，一半組織放入液氮中凍存，另一半放入多聚甲醛中固定，并標(biāo)明組別及周期;大體觀察大鼠皮膚缺損修復(fù)后愈合情況及移植真皮血管化情況。

1.5 HE、VG 染色觀察

組織標(biāo)本制取:1)取材:實驗組與對照組取標(biāo)本大小為2.0cm×0.5cm，厚度約為0.5mm。2)固定:多聚甲醛固定。3)脫水(在脫水機(jī)中進(jìn)行):從30%乙醇開始，經(jīng)過50%、70%、80%、95%、100%至完全脫水。4)包埋:表面石蠟?zāi)毯罅⒓磳⒓埡邪慈胨校蛊溲杆倮鋮s凝固，30min后取出。5)切片:觀察各組實驗標(biāo)本中各層細(xì)胞及血管長入材料的情況，及膠原纖維的分布及排列情況等(HE染色:細(xì)胞漿為紅色，細(xì)胞核為藍(lán)紫色;VG染色:膠原纖維呈紅色、肌肉、神經(jīng)膠質(zhì)、胞漿、血管呈黃色，細(xì)胞核呈黑藍(lán)色或棕藍(lán)色)。

1.6 RT－PCR定量檢測液氮保存的各組標(biāo)本中表皮生長因子(EGF)含量

引物的設(shè)計:表皮生長因子(EGF)的上游引物為5'－GTCTCGACGTTGATGAGTGCC－'3，下游引物為5'－CCGTCTTGACTTCGGTTTCTG－'3;β－actin的上游引物為5'－GGATGCCACAGGATTCCATACCC－'3，下游引物為5'－GTGTTGGCCCTGTATGCCTCTGG－'3。

樣本總RNA的提取及PCR產(chǎn)物的制備:TRIZOL法分別提取12組標(biāo)本的總RNA，紫外分光光度儀檢測RNA質(zhì)量和濃度;步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，所得cDNA置－20℃保存。EGF引物分子量為1 152bp，β－actin分子量為406bp，RT反應(yīng)體系為10μl。采用濃度1%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳產(chǎn)物經(jīng)EP熒光染色后紫外燈下觀察結(jié)果，采用DH－2000 DigitalImaging Systems儀分析圖像。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件作統(tǒng)計分析，定量RT－PCR的數(shù)據(jù)結(jié)果用t檢驗進(jìn)行組間差異顯著性統(tǒng)計學(xué)分析，以(s)表示，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 動物實驗標(biāo)本大體觀察

術(shù)后4周，實驗組(鹽酸川芎嗪腹腔注射)植皮區(qū)愈合良好，取材時肉眼觀察到實驗組大鼠PADM血管化程度明顯高于對照組，且皮膚觸之彈性較好，而對照組皮膚彈性一般;空白組植皮區(qū)基本愈合且成活率較高，但皮片因缺乏真皮層，觸之較硬，最終形成瘢痕樣組織。在創(chuàng)口愈合時間及皮片成活方面實驗組優(yōu)于對照組。

2.2 HE、VG 染色觀察

HE染色結(jié)果顯示，實驗組中細(xì)胞較多的移入移植材料PADM中，胞核濃染，可見基底細(xì)胞排列整齊，上皮細(xì)胞排列完整，真皮層(PADM)血管豐富，無炎性細(xì)胞浸潤;對照組中可見上皮釘突伸長，上皮細(xì)胞排列基本完整，角化層明顯，亦可見細(xì)胞移入真皮層(PADM)中，并有少量血管存在;空白組中可見大量毛囊等皮膚附件，胞核濃染，無皮膚真皮層，上皮過角化并可見莢膜存在。

VG染色結(jié)果顯示，實驗組可見膠原排列呈卷曲狀且整齊、規(guī)則，較為接近大鼠自體皮膚，真皮層(PADM)間存在較密集黃染的毛細(xì)血管;對照組膠原排列較為整齊，但真皮層(PADM)間血管化不明顯;空白組膠原纖維排列紊亂無規(guī)則，與瘢痕的膠原排列情況較為接近。

2.3 RT－PCR結(jié)果 結(jié)果見圖1，圖2，表1。

圖1 各組EGF mRNA及β－actin光密度值的曲線分析

鹽酸川芎嗪腹腔注射組EGF mRNA的表達(dá)明顯高于對照組和空白對照組，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析(見表1)，鹽酸川芎嗪腹腔注射組EGF條帶光密度/β－actin條帶光密度的值與對照組和空白組相比，有差異(P＜0.05);對照組與空白組比較，無差異(P＞0.05)。

表1 EGF mRNA在各組中的相對表達(dá)含量(s)

表1 EGF mRNA在各組中的相對表達(dá)含量(s)

注:與對照組相比，*P＜0.05;與空白組比較，△P＜0.05，○P＞0.05。

組別 n K值實驗組 6 1.264 ±0.359＊△0.830 ±0.121對照組 6 0.904 ±0.128○空白組6

K值=目的基因光密度值/β－actin光密度值，既各組EGFmRNA表達(dá)的相對含量。

圖2 EGF mRNA在各組的表達(dá)

3 討論

實驗表明，鹽酸川芎嗪用藥組SD大鼠背部植皮區(qū)血管化明顯，皮膚缺損修復(fù)后有彈性，為良性愈合;RT－PCR定量檢測結(jié)果表明，實驗組植皮區(qū)表皮生長因子(EGF)單位表達(dá)量明顯高于對照組和空白組;而HE染色及VG特殊染色都觀察到實驗組血管化程度和膠原排列的完整性和規(guī)則度高于對照組［2］，明顯高于空白組。因此可以認(rèn)為，鹽酸川芎嗪具有促進(jìn)其植皮區(qū)血管化，有助于植皮的成活和良性愈合的作用。各組植皮區(qū)的EGF單位表達(dá)量雖然隨植皮愈合時間的延長而下降，但在14天和21天這兩個時間點，實驗組EGF單位表達(dá)量均顯著高于對照組和空白組，對照組和空白組之間的EGF單位表達(dá)量并無明顯差異，提示鹽酸川芎嗪可能是通過提高EGF的表達(dá)而達(dá)到促進(jìn)植皮區(qū)生長及愈合的。

鹽酸川芎嗪有效抑制血小板的聚集、減輕缺血－再灌注損傷后內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞的黏附及提高植皮區(qū)的微循環(huán)［6－8］，可能與其提高EGF的表達(dá)量具有協(xié)同作用［9］，一同完成植皮區(qū)早期血供的建立進(jìn)而提高復(fù)合皮片的成活率，而鹽酸川芎嗪抑制成纖維細(xì)胞的過度增殖，在前膠原基因的轉(zhuǎn)錄水平影響瘢痕成纖維細(xì)胞的膠原合成，從而減少瘢痕組織形成［10］，又有助于植皮成活后復(fù)合皮片的良性愈合，防止瘢痕的形成，進(jìn)而達(dá)到修復(fù)與美觀的雙重目的，為臨床治療皮膚缺損提供了新的思路。

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