付 俊,繆時英

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實驗室,北京 100005

哺乳動物的精子發(fā)生是一個復(fù)雜的細(xì)胞分化過程,其依賴于一個真正的干細(xì)胞群體,它們具有自我更新和產(chǎn)生后代分化為精子的能力[1]。精子發(fā)生按其順序,大致包括3個階段:第1階段是精原干細(xì)胞經(jīng)有絲分裂、分化發(fā)育形成初級精母細(xì)胞;第2階段是初級精母細(xì)胞經(jīng)第1次減數(shù)分裂形成次級精母細(xì)胞,再經(jīng)第2次減數(shù)分裂形成單倍體圓形精子細(xì)胞;第3階段是精子細(xì)胞變態(tài),包括頂體發(fā)生、核濃縮拉長、尾形成,多余胞質(zhì)脫落,最終形成具有頭、頸、尾幾個結(jié)構(gòu)的高度分化的精子[2-3]。

根據(jù)精子的發(fā)育階段和形態(tài),一般將精子發(fā)生分為精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞和長形精子細(xì)胞等幾個階段。很多涉及到精子發(fā)生的蛋白質(zhì)在各個階段進(jìn)行精細(xì)的調(diào)節(jié)[4-6]。在研究這些蛋白質(zhì)的功能前,先檢測這些蛋白質(zhì)在精子發(fā)生過程中的定位以及隨著精子發(fā)生其定位是否有所變化,對于分析這些蛋白質(zhì)在精子發(fā)生過程中的功能具有重要的作用。以往的研究者常采用睪丸切片免疫組織化學(xué)或者免疫熒光的方法,來檢測某些蛋白質(zhì)在精子發(fā)生過程中的定位[7-8],但睪丸中各種類型、各個階段的細(xì)胞有序而又緊密地排列在一起,欲觀察蛋白質(zhì)在精子發(fā)生的某個階段中較為精細(xì)的定位比較困難。本研究擬建立一種簡單可行的研究精子發(fā)生過程中蛋白質(zhì)定位的方法,以期為進(jìn)一步研究其功能打下良好的基礎(chǔ)。

材料和方法

材料 ICR品系健康雄性小鼠,購自維通利華實驗動物公司;細(xì)胞核染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)購自瑞士Roche公司,頂體特異染料異硫氰酸熒光素 (fluorescein isothiocyanate,FITC)標(biāo)記的花生凝集素 (peanut agglutinin,PNA)購自美國Sigma公司;山羊血清、封片劑購自中杉金橋生物技術(shù)公司。

生精細(xì)胞的分離 將小鼠斷頸處死,打開腹腔找到睪丸,將睪丸取下,去除脂肪組織及白膜,留下曲細(xì)精管;在磷酸緩沖液中洗1次,并去除血管;將曲細(xì)精管與2.5 mg/ml的膠原酶Ⅰ及20μg/ml的DNA酶Ⅰ混合,于35℃水浴20～30 min細(xì)精管分離為單個而不黏連;用磷酸緩沖液洗2次,每次顛倒混勻后靜置,去除上清;用剪口的槍頭反復(fù)吹吸,將細(xì)胞打散后,室溫靜置。細(xì)胞因重力原因分為3層,分別取各層中的細(xì)胞觀察細(xì)胞種類是否齊全,一般取中間一層細(xì)胞種類較為齊全且為較分散的細(xì)胞層,取出稀釋到合適的濃度,涂片于載玻片上。

熒光染色 涂片自然晾干,用4%多聚甲醛固定液室溫固定10～15 min;磷酸緩沖液漂洗3次,每次5 min。室溫下用0.5%TritonX-100的磷酸緩沖液處理涂片10 min;磷酸緩沖液漂洗3次,每次5 min;以3%BSA封閉,37℃,30 min;磷酸緩沖液漂洗3次 ,每次5 min。以1μg/ml濃度的 DAPI染細(xì)胞核,室溫5 min。再以20μg/ml的PNA染精子頂體,室溫避光染色30～60 min;磷酸緩沖液漂洗3次,每次5 min;去離子水漂洗去鹽2次,每次5 min。取10μl封片劑滴在載玻片上,蓋上蓋玻片,四周用指甲油封邊;用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察并照相。

結(jié) 果

精原細(xì)胞的形態(tài) 精原細(xì)胞的細(xì)胞核小而致密,染色質(zhì)多集中在靠近核膜的區(qū)域,頂體染料PNA染色為陰性 (圖1)。

精母細(xì)胞的形態(tài) 細(xì)胞核較大,染色較淺,頂體染料PNA染色依然為陰性 (圖2)。

早期圓形精子細(xì)胞的形態(tài) 和精母細(xì)胞相比,圓形精子的細(xì)胞核比較小,可見細(xì)胞核的一側(cè)有很小的頂體小泡開始生成;隨著圓形精子細(xì)胞的發(fā)育,頂體小泡也開始生長,其覆蓋細(xì)胞核表面的比例越來越大 (圖3)。

晚期圓形精子細(xì)胞的形態(tài) 晚期的圓形精子細(xì)胞,細(xì)胞核的大小和形態(tài)與早期圓形精子細(xì)胞差不多,但是隨著頂體的發(fā)生生長,頂體已覆蓋細(xì)胞核表面接近于50%的區(qū)域 (圖4)。

早期長形精子細(xì)胞的形態(tài) 進(jìn)入長形精子時期的精子細(xì)胞,細(xì)胞核開始濃縮拉伸,不再維持之前的圓形,隨著細(xì)胞核開始不對稱,頂體也開始偏向于細(xì)胞核的一側(cè),精子細(xì)胞的極性,即腹側(cè)面和背側(cè)面開始逐漸形成 (圖5)。

晚期長形精子細(xì)胞的形態(tài) 晚期長形精子的細(xì)胞核繼續(xù)變形,接近于成熟的精子,頂體完全覆蓋了細(xì)胞核的背側(cè)而在腹側(cè)沒有頂體 (圖6)。

討 論

睪丸的結(jié)構(gòu)比較特殊,各種形態(tài)的生精細(xì)胞、體細(xì)胞在其中有序而又緊密地排列,這種緊密排列關(guān)系,使觀察某個時期細(xì)胞較為精細(xì)的結(jié)構(gòu)變得困難。針對這一難點(diǎn)本研究采用同時利用膠原酶和DNA酶消化曲細(xì)精管的方法,快速地將小鼠睪丸中緊密排列的各種類型的細(xì)胞分離開,得到種類齊全的各種生精細(xì)胞。將這些細(xì)胞涂片于載玻片上后,使細(xì)胞平鋪于載玻片上,而不是緊密地排列,從而利于觀察。然而在普通的光學(xué)顯微鏡下,不能明確的分辨各種生精細(xì)胞。經(jīng)特異的熒光染料DAPI和PNA染色后,通過共聚焦顯微鏡掃描,可以清晰地觀察到小鼠曲細(xì)精管中生精細(xì)胞的細(xì)胞核和頂體的發(fā)育過程。生精細(xì)胞的細(xì)胞核發(fā)育從精原細(xì)胞開始經(jīng)歷了小而深染色,大而淺染色,濃縮變小、變形,最終形成了具有極性的成熟的細(xì)胞核;生精細(xì)胞的頂體發(fā)育從早期的圓形精子細(xì)胞開始,在細(xì)胞質(zhì)中生成頂體小泡并靠近細(xì)胞核,沿著細(xì)胞核延伸擴(kuò)大,最終隨著細(xì)胞核的變形,形成了覆蓋其一側(cè)具有極性的特征性結(jié)構(gòu)[5-6]。細(xì)胞核的變形和頂體的形成是精子發(fā)生過程中的標(biāo)志性事件。正是通過這些過程中的形態(tài)特征可以區(qū)分處于不同時期的精子細(xì)胞。在這一過程中,如果對某個目的蛋白質(zhì)進(jìn)行染色,通過頂體的形態(tài)和細(xì)胞核的形態(tài)來判斷生精細(xì)胞所處的階段,就可以分析出這個目的蛋白質(zhì)在某個生精細(xì)胞階段的定位。將各個生精細(xì)胞階段的定位聯(lián)系在一起,就可以分析出這個蛋白質(zhì)在生精過程中定位的變化,進(jìn)而對其功能作用有所提示。

這種方法的使用也有局限性,其較適用于檢測蛋白質(zhì)在精子發(fā)生過程中某個時期細(xì)胞中的定位,比如分析蛋白質(zhì)與精子細(xì)胞變形、頂體發(fā)生是否有關(guān)等。但由于操作過程中已經(jīng)打破了細(xì)胞和細(xì)胞之間的連接,因此不適用于分析生精上皮中各個細(xì)胞間的連接關(guān)系。

圖1 精原細(xì)胞的形態(tài)觀察Fig 1 Morphological observation of spermatogonia

圖2 精母細(xì)胞的形態(tài)觀察Fig 2 Morphological observation of spermatocyte

圖3 早期圓形精子細(xì)胞的形態(tài)觀察Fig 3 Morphological observation of early round spermatids

圖4 晚期圓形精子細(xì)胞的形態(tài)觀察Fig 4 Morphological observation of late round spermatids

圖5 早期長形精子細(xì)胞的形態(tài)觀察Fig 5 Morphological observation of early elongated spermatids

圖6 晚期長形精子細(xì)胞的形態(tài)觀察Fig 6 Morphological observation of late elongated spermatids

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