李 萍，張 靖，李愛花，王 珊，談小超，陰 彬，彭小忠

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100005

·論著·

小鼠大腦皮層層次特異表達基因天然反義轉(zhuǎn)錄物的篩選與鑒定

李 萍，張 靖，李愛花，王 珊，談小超，陰 彬，彭小忠

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100005

目的篩選并鑒定小鼠大腦皮層發(fā)育過程中皮層層次特異表達的基因是否存在天然反義轉(zhuǎn)錄物(NAT)。方法對63個小鼠大腦皮層層次特異表達的基因進行生物信息學(xué)預(yù)測，篩選出31個可能存在NAT的基因，從小鼠腦組織及神經(jīng)系統(tǒng)來源的細胞系提取總RNA，采用RT-PCR方法對篩選陽性基因進行鑒定并克隆到pGEM-T載體中進行測序。結(jié)果31個經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測的基因中，8個為NAT陽性。結(jié)論小鼠大腦皮層發(fā)育過程中皮層層次特異表達的基因存在NAT，NAT可能通過調(diào)控編碼基因影響小鼠皮層發(fā)育。

天然反義轉(zhuǎn)錄物；小鼠大腦皮層；篩選；鑒定

NAT由蛋白編碼基因的反義鏈轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，屬于一類新的長非編碼RNA，其中少數(shù)可以編碼蛋白，根據(jù)其編碼方式可分為兩種：(1)順式NAT(cis-NAT)：與其對應(yīng)編碼基因來源于相同的基因組位點，由編碼有義轉(zhuǎn)錄物的相對鏈所編碼，與靶基因的序列完全互補；(2)反式NAT(trans-NAT)：與編碼基因來源于不同的基因組位點，與有義轉(zhuǎn)錄物只是部分互補[1]。NAT與對應(yīng)的正義RNA(sense RNA)通過堿基互補配對，形成正義-反義轉(zhuǎn)錄物(sense- antisense transcript，SAT)，影響靶mRNA的穩(wěn)定性或翻譯[2]。1976年，Barrell 等[3]在病毒中首次發(fā)現(xiàn)NAT的存在，此后越來越多有功能的NAT被發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平對其對應(yīng)的sense RNA 發(fā)揮調(diào)控作用。Emx2為中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達的轉(zhuǎn)錄因子，可對大腦皮層發(fā)育中神經(jīng)細胞的分化、遷移和神經(jīng)前體細胞增殖等發(fā)揮重要的調(diào)控作用。Spigoni等[4]通過RT-PCR和原位雜交等技術(shù)發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元前體細胞中Emx2OS-ncRNA對Emx2進行轉(zhuǎn)錄后下調(diào)，而敲除Emx2基因后Emx2OS-ncRNA轉(zhuǎn)錄水平降低，說明Emx2及其NAT之間存在相互調(diào)控，并可能間接影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。本研究以小鼠大腦皮層特異表達基因為研究對象，篩選并鑒定了其NAT。

材料和方法

材料pGEM-T 載體、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司，Trizol購自美國Invitrogen公司，T4 DNA連接酶，RQ1 RNase-Free DNase購自美國Promega公司。E12.5的胎鼠及成年小鼠品系均為ICR，所用細胞系為小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)和NIH小鼠胚胎成纖維細胞(NIH3T3)均購自美國ATCC公司。

細胞培養(yǎng)將NIH3T3與MEF細胞系置于含10%胎牛血清(體積分?jǐn)?shù))+100 U/ml青霉素+100 U/c鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

細胞與組織RNA的提取及去DNA處理對于貼壁生長的細胞，先用PBS洗細胞1～2次，然后按照每(5～10)×106個細胞:1 ml Trizol的比例直接將Trizol加入到細胞培養(yǎng)皿中；取新鮮鼠腦組織在液氮中研磨，制成1 mg組織:1 ml Trizol的比例，氯仿抽提，于-20℃異丙醇沉淀過夜，75%乙醇漂洗2次后，空氣干燥，并加入適量DEPC處理過的水溶解。對提取的RNA進行去DNA處理所用的是RNase-Free DNase，具體為每消化10-3mg RNA用1個單位的RQ1 RNase- Free，37℃處理0.5 h，然后用異丙醇沉淀過夜，純化RNA樣品。

候選基因的選擇和引物設(shè)計選擇在皮層的一層或幾層特異表達或者對皮層發(fā)育產(chǎn)生重要影響的63種基因(圖1)，在北大生物信息學(xué)網(wǎng)站http://natsdb.cbi.pku.edu.cn/進行初篩，篩選出31個NAT陽性的基因，由于引物設(shè)計等原因本研究實際的擴增長度要小于轉(zhuǎn)錄本的長度(表1)。

RT-PCR本實驗的總RNA來源分別是成年鼠腦組織，12.5 d胎鼠腦組織、MEF、NIH373，提取總RNA后，用鏈特異性引物(G)及隨機引物(R)分別做逆轉(zhuǎn)錄并進行PCR反應(yīng)，所用逆轉(zhuǎn)錄的引物均為PCR的下游引物。陰性對照的PCR體系中未加模板。

克隆測序31個逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物都進行PCR檢測，將得到的特異條帶進行切膠回收，用DNA純化試劑盒純化，將純化的DNA產(chǎn)物連接到pGEM-T 載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，挑選陽性克隆，送美國Invitrogen公司測序部進行測序，與原始序列比對一致的基因判定為NAT陽性基因 。

Ⅰ～Ⅵ：小鼠大腦新皮層第1層到第6層 ； SP：皮層下板Ⅰ-Ⅵ：layerⅠ-Ⅵ of mouse neocortex ；SP：subplate

表 1 生物信息學(xué)預(yù)測出的31個可能存在NAT的皮層發(fā)育相關(guān)基因

NAT：天然反義轉(zhuǎn)錄物
NAT: natural antisense transcript

結(jié) 果

RT-PCR驗證和克隆測序結(jié)果顯示，31個經(jīng)生物信息學(xué)篩選的基因中，有8個驗證正確(圖2)。

M:PBR322-BstNI分子標(biāo)記；G: 鏈特異性引物;R：隨機引物;E12.5： 12.5 d胎鼠; MEF：小鼠胚胎成纖維細胞； 3T3： NIH小鼠胚胎成纖維M: PBR322-BstNI Marker；G:gene specific primer；R：random primer ；E12.5：mouse embryonic day 12.5; MEF：mouse embryonic fibroblast；3T3：NIH mouse embryonic fibroblast

討 論

NAT為一種長的非編碼RNA，是天然存在的反義RNA分子，在哺乳動物基因組中大多數(shù)NAT不能編碼蛋白。Katayama等[2]用cDNA克隆大規(guī)模測序技術(shù)分析小鼠基因組(共43 553個轉(zhuǎn)錄元件)，發(fā)現(xiàn)與cDNA中互補鏈重疊且含有轉(zhuǎn)錄元件易于形成NAT的基因占全基因組的28.7%(12 519個)。非編碼RNA形成了龐大的網(wǎng)絡(luò)，對基因的表達調(diào)控起著至關(guān)重要的作用，對生物生長發(fā)育、疾病發(fā)生等生理過程具有廣泛影響。Faghihi等[5]用大規(guī)模的RNAi技術(shù)在人類797個進化保守的NAT中篩選到7個對其編碼基因有調(diào)控作用的NAT。目前研究表明，long non- coding RNA在神經(jīng)干細胞命運決定、分化和表觀調(diào)控中起到發(fā)揮了極其重要的作用[6]。NAT主要通過以下4種機制發(fā)揮作用：(1)轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)機制；(2)在細胞核內(nèi)的DNA-RNA相互作用；(3)細胞核中RNA-RNA相互作用；(4)在細胞質(zhì)中的RNA-RNA相互作用[7]。本研究中的候選基因幾乎涵蓋了所有皮層特異表達的基因[8]，它們除了在皮層特異層次表達之外，在層次發(fā)生過程中也發(fā)揮了重要作用。例如：Lhx就在皮層發(fā)育兩個相對獨立方面發(fā)揮作用[9]，一方面它表達在室管膜區(qū)(ventricular zone, VZ)和室管膜下區(qū)(subventricular zone, SVZ)的前體細胞中，另一方面也表達在上層成熟的(有絲分裂后的)神經(jīng)元中，提示其在前體細胞命運決定中起到?jīng)Q定作用，在上層神經(jīng)元分化過程中也有一定功能，因為當(dāng)敲除Lhx后所有層次的神經(jīng)元均有缺失[10-11]。本研究選取了63個皮層發(fā)育相關(guān)的重要基因，經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測出31個NAT可能為陽性的基因，篩選陽性的比例為49.2%，而驗證后陽性為8個，驗證陽性比率25.8%。8個重要NAT的發(fā)現(xiàn)為后續(xù)功能的研究提供了基礎(chǔ)。為了進一步對NAT功能做探索，下階段的工作是應(yīng)用RACE，Northern blot等技術(shù)手段觀察在在體水平各個NAT的表達情況，并深入探討其分子機制。

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ScreeningandIdentificationofNaturalAntisenseTranscriptinMouseCerebralCortex

LI Ping, ZHANG Jing, LI Ai-hua, WANG Shan, TAN Xiao-chao,YIN Bin, PENG Xiao-zhong

National Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS and PUMC, Beijing 100005, China

PENG Xiao-zhong Tel: 010-65295945，E-mail: peng_xiaozhong@163.com

ObjectiveTo screen and identify the possible existence of natural antisense transcript (NAT) within the mouse neocortex.MethodsSixty-three cerebral cortex layer-specific genes were screened by bioinformatics prediction in mice, among which 31 mice with potential NATs were screened. NAT was identified using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and then cloned in pGEM-T Vector System for sequencing.ResultsAmong 31 genes predicted using bioinformatics, 8 were proved to be NAT positive by RT-PCR.ConclusionsNATs exist in the mouse neocortex tissue during the development of cerebral cortex. NATs may influence mouse cortical development by regulating the related coding genes.

natural antisense transcript; mouse cerebral cortex; screening; identification

ActaAcadMedSin，2011，33(6)：620-623

彭小忠 電話：010-65295945，電子郵件：peng_xiaozhong@163.com

R739.41

A

1000-503X(2011)06-0620-04

10.3881/j.issn.1000-503X.2011.06.007

國家自然科學(xué)基金(31071203)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(31071203)

2011-10-20)