陳 詠，林 晨，張 晶，邱 彬，周 欣，宋洪濤(.福州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 ，福建 福州 50002;2.福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福州 500;.福建省藥品檢驗(yàn)所，福建 福州 50025;.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院藥學(xué)科，福建 福州 50025)

西羅莫司 (sirolimus，rapamycin，SRL)是一種新型、強(qiáng)效的免疫抑制劑，1999年10月在美國首次上市，用于預(yù)防器官移植患者的急性排斥反應(yīng)［1］。西羅莫司具有骨髓抑制和高血脂的不良反應(yīng)，文獻(xiàn)［2］表明西羅莫司谷濃度與其免疫抑制效價(jià)和藥物副作用有關(guān)。因此本課題組將其制備成緩控釋制劑，以降低達(dá)峰濃度，維持較為平穩(wěn)的血藥濃度，使藥物的有效性、安全性及適應(yīng)性均有所提高。由于西羅莫司的生物利用度比較低，個(gè)體差異大，治療指數(shù)窄［1］，需要靈敏的檢測(cè)方法，所以本文擬建立UPLC－MS/MS的方法來測(cè)定西羅莫司在beagle犬全血中的藥物濃度，用于研究西羅莫司制劑在beagle犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征，為人體研究及臨床合理用藥提供參考。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑 西羅莫司對(duì)照品(SRL，含量99.9%，福建科瑞藥業(yè)有限公司，批號(hào)070703);他克莫司對(duì)照品(tacrolimus，F(xiàn)K506，含量 99.9%，福建科瑞藥業(yè)有限公司，批號(hào)080301);乙腈、乙醚為色譜純、水為高純水。

1.2 儀器 Agilent 6410高壓液相色譜質(zhì)譜儀(包括1200系列HPLC:G1312B二元泵，G1379B脫氣機(jī)，G1367C自動(dòng)進(jìn)樣器;G1316A柱溫箱;G6410AA質(zhì)譜儀:四極桿串接質(zhì)譜儀，API－ES電噴霧源，G1947B大氣壓化學(xué)電離源，美國 Agilent公司);TDZ5－WS型多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司);WH－1微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 6只健康beagle犬(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(川)2004－15)，體重為(12.4 ±2.16)kg，受試犬無肝腎功異常，近兩周未使用過任何藥物。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件的建立 色譜柱為Agilent C18柱(50 mm × 2.1 mm，1.7 μm，美國 Agilent公司);預(yù)柱為C18柱(4.0 mm × 3.0 mm，5 μm，美國 Agilent公司);流動(dòng)相為乙腈－水(90∶10，v/v);流速為 0.30 ml/min;進(jìn)樣量為20 μl;柱溫為50℃;進(jìn)樣室溫度為4℃。

2.2 質(zhì)譜條件的建立 離子源為ESI源;正離子方式檢測(cè);掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);離子源電離電壓為3 500 V;離子源溫度350℃;霧化氣流速10 L/min;用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z 936.6→m/z 409.7(西羅莫司)和 m/z 826.6→m/z 415.4(內(nèi)標(biāo)他克莫司)(見圖 1，2);碎裂電壓(fragmentor)分別為290 eV和230 eV;碰撞能量(collision energy)分別為63 eV和60 eV;掃描時(shí)間為200 ms。

2.3 溶液的配制

2.3.1 SRL標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取SRL對(duì)照品10 mg，置100 ml量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻。精密量取該溶液適量，分別配制成濃度為5、10、20、40、60、80、100、120 ng/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱取他克莫司對(duì)照品10 mg，置100 ml量瓶中，加乙腈稀釋至刻度線，搖勻。取該溶液適量，配制成濃度為20 ng/ml的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.4 全血樣本處理方法 向500 μl全血中依次加入100 μl的內(nèi)標(biāo)溶液(0.020 ng/ml他克莫司乙腈溶液)，100 μl乙腈︰水(50∶50，v/v)和 500 μl的水，混勻后加入4 ml乙醚，渦流混合1 min，往復(fù)振蕩 15 min(240 r/min)，離心5 min(3 500 r/min)，分取上層有機(jī)相于另一試管中，40℃氮?dú)饬飨麓蹈?，殘留物加?50 μl流動(dòng)相溶解，渦流混合，取20 μl進(jìn)行UPLC－MS/MS分析。

2.5 方法專屬性考察 取beagle犬的空白全血，除不加內(nèi)標(biāo)外，其他按“2.4”項(xiàng)下操作，記錄色譜圖(見圖3);另取beagle犬的空白全血，先配制成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)全血樣品，再依“2.4”項(xiàng)下操作并測(cè)定，記錄色譜圖(見圖4);取服藥后的全血樣品，依“2.4”項(xiàng)下進(jìn)行操作并測(cè)定，記錄色譜圖(見圖5)。由圖觀察到，西羅莫司的保留時(shí)間約為1.167 min，內(nèi)標(biāo)他克莫司的保留時(shí)間約為1.144 min。全血中本底及雜質(zhì)對(duì)西羅莫司和他克莫司的測(cè)定沒有任何干擾。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 取450 μl的空白全血數(shù)份，分別加入50 μl的SRL標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，混合均勻。配制成相當(dāng)于西羅莫司濃度為 0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00、12.00 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)全血樣品。按“2.4”項(xiàng)下進(jìn)行操作，記錄色譜圖。以待測(cè)物濃度(ng/ml)為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)(W=1/X2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得直線回歸方程為Y=0.201 6X －0.0031，r=0.999 7。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，西羅莫司測(cè)定方法的線性范圍為0.50 ～12.00 ng/ml。

2.7 最低定量濃度 取SRL濃度為0.50 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)全血樣品，按“2.6”項(xiàng)下進(jìn)行6樣本分析，根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線求得每一樣本測(cè)定濃度，求得該濃度下的西羅莫司日內(nèi)精密度(RSD)為13.1%，準(zhǔn)確度為97.0%。該結(jié)果表明LC－MS/MS法測(cè)定全血中西羅莫司的定量下限可達(dá)0.50 ng/ml。

2.8 精密度和方法回收率試驗(yàn) 取450 μl的空白全血數(shù)份，按“2.6”項(xiàng)下的方法配制低、中、高3個(gè)濃度(西羅莫司濃度分別為 1.0、4.0 和 8.0 ng/ml)的質(zhì)量控制樣品，每一濃度進(jìn)行6樣本分析，連續(xù)測(cè)定3 d，記錄色譜圖。根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算質(zhì)量控制樣品的測(cè)得濃度，計(jì)算本法的精密度和方法回收率，詳見表1。結(jié)果表明，本方法精密、準(zhǔn)確，符合生物樣本分析要求。

表1 全血樣品中西羅莫司的方法回收率和精密度

2.9 全血樣品萃取回收率試驗(yàn) 取450 μl的空白全血數(shù)份，按“2.6”項(xiàng)下的方法制備低、中、高3個(gè)濃度(西羅莫司濃度分別為1.0，4.0 和8.0 ng/ml)的全血樣品，每一濃度進(jìn)行6樣本分析。同時(shí)另取450 μl的空白全血，除不加內(nèi)標(biāo)溶液外，按“2.4”項(xiàng)下操作，向獲得的上層有機(jī)相中加入相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μl和內(nèi)標(biāo)溶液100 μl，渦流混合，取混合液40 C氮?dú)饬飨麓蹈?。殘留物加?50 μl流動(dòng)相溶解，渦流混合，取20 μl進(jìn)行LC－MS/MS分析。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計(jì)算提取回收率。3種濃度下西羅莫司的提取回收率分別為 76.0%，81.7%，80.2%(n=6)。同樣計(jì)算他克莫司的提取回收率為89.2%。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取450 μl的空白全血數(shù)份，按“2.6”項(xiàng)下的方法配制低、中、高3個(gè)濃度(西羅莫司濃度分別為1.0、4.0 和8.0 ng/ml)的質(zhì)量控制樣品數(shù)份。將西羅莫司全血樣品在不同溫度下(25℃、4℃、－20℃)避光貯存，分別進(jìn)行不同溫度下不同時(shí)間的穩(wěn)定性試驗(yàn)考察;將全血樣品在－20℃下避光貯存，1周后取出在常溫下解凍，分別進(jìn)行1、2、3個(gè)凍融周期的穩(wěn)定性試驗(yàn)考察。根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算質(zhì)量控制樣品的測(cè)得濃度，結(jié)果表明西羅莫司在冷凍(－20℃)條件下至少能穩(wěn)定15 d，準(zhǔn)確度為85.2% ～95.0%(n=6);在4℃條件下至少能穩(wěn)定 8 h，準(zhǔn)確度為 85.0% ～95.9%(n=6);在室溫(25℃)條件下至少能穩(wěn)定 4h，準(zhǔn)確度為85.3% ～94.5%(n=6);反復(fù)凍融 3 個(gè)周期，血藥濃度未發(fā)生顯著變化，準(zhǔn)確度為85.7% ～93.6%(n=6)，均符合生物樣品分析要求。

3 討論

由于血中SRL小部分與血漿蛋白結(jié)合，大部分與紅細(xì)胞結(jié)合，所以測(cè)定時(shí)需用全血［3］。

國內(nèi)外文獻(xiàn)［4～9］中分別采用UPLC－MS/MS、HPLC－/MS/MS、HPLC法、酶聯(lián)免疫法等方法測(cè)定全血中西羅莫司的濃度。本實(shí)驗(yàn)采用UPLC－MS/MS檢測(cè)beagle犬體內(nèi)西羅莫司血藥濃度，與其他方法比較，UPLC－MS/MS具有更高的分離效率和更快的分離速度，尤其與質(zhì)譜聯(lián)用后更能顯示其優(yōu)越的性能，由于不需要組分完全分離，大大縮短了保留時(shí)間，且靈敏度提高數(shù)倍。

本實(shí)驗(yàn)分別采用沉淀蛋白法(PPT)、液液萃取法(LLE)及固液萃取法(SPE)3種方法處理樣本，并進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn):使用PPT方法，快速簡(jiǎn)便，但內(nèi)源性物質(zhì)不能完全分離，不利于儀器的保護(hù);LLE法采用乙醚作為萃取溶劑時(shí)，提取回收率約有76%，而SPE方法82%，會(huì)稍高一些，重復(fù)性亦好于LLE法。但采用SPE法時(shí)，發(fā)現(xiàn)因?yàn)檠獦咏M成復(fù)雜，重復(fù)使用SPE小柱，使提取效率明顯下降，故要有滿意的效果，不能再生使用，考慮到本實(shí)驗(yàn)的樣品數(shù)量多，選用LLE方法能有效降低實(shí)驗(yàn)成本。因此最終選定LLE法做為血樣萃取方法。

本實(shí)驗(yàn)中所建立的UPLC－MS/MS方法具有樣品處理簡(jiǎn)單，方法靈敏、快速、選擇性強(qiáng)，能滿足西羅莫司在beagle犬體內(nèi)藥物檢測(cè)的要求。

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