陳 林，羅永杰，熊 毅

(1.四川省樂山市人民醫(yī)院神經內科，四川 樂山 614800;2.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院神經內科，四川 成都 610072)

最新WHO調查顯示:腦血管疾病(CVD)是目前導致人類死亡的第二大疾病，幸存者中也有50%以上的致殘率，給社會及家庭帶來沉重的負擔［2］。Jin等［3］認為，VEGF有神經營養(yǎng)作用，在新血管形成之前，VEGF對神經組織有直接保護作用，這有助于延長細胞的存活時間，此保護作用直到新血管形成。VEGF在分子水平上變化對缺血環(huán)境發(fā)生適應，減輕缺血、缺氧對機體的損害。但是因子在梗死后不同時間點的具體表達特點和相關機制卻不甚明確。本課題組2010年6月至2011年4月通過觀察SD大鼠右側局灶性腦缺血后血清中VEGF隨時間的動態(tài)變化，探討因子的表達與急性腦梗死的關系。為臨床腦梗死的治療和相關藥物研究提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗動物為2～3月齡SPF級SD大鼠，體重250～320 g，雌雄各半，購于四川省簡陽市實驗動物基地。隨機分至籠中飼養(yǎng)，按統(tǒng)計學中的隨機數(shù)列編號，總共36只大鼠，隨機分為手術組16只、假手術組16只、空白組4只，手術組和假手術組又各分為 A、B、C、D4個小組，每組分別于1/2、2、3、6、12、24、72、168 h 共8 個時間點采血。

1.2 主要實驗試劑 ①戊巴比妥;②多聚耐氨酸;③多聚甲醛(溶海生物技術有限公司);④大鼠VEGF酶聯(lián)免疫分析(Elisa)試劑盒(深圳欣博盛生物科技有限公司提供96t貨號ERC103);⑤PBS粉劑(成都溶海生物技術有限公司);⑥NaOH、HCL。

1.3 主要實驗儀器 ①手術顯微鏡、眼科剪、微動脈夾等顯微手術器械;②離心機，離心管;③37℃恒溫箱，pH試紙;④軌道式搖床(美國Forma公司，MODEL-420);⑤ －80℃冰箱(SANYO，MDFU4086S);⑥可調移液器;⑦MK3酶標儀，酶聯(lián)免疫加速儀(上海復星);⑧高精度電子分析天平;⑨魚線2、3號，直徑分別為0.23 mm、0.28 mm;⑩智能型電熱恒溫培育箱(上海瑯玕)，數(shù)顯恒溫水箱。

1.4 實驗方法

1.4.1 建立模型［4，5］參照改良線栓法閉塞大鼠右側大腦中動脈，制作大鼠局灶性腦梗死模型。

1.4.2 模型評分標準 ①神經功能評分:根據(jù)Longa等創(chuàng)立的5級評分法，在大鼠清醒后(術后30～60分鐘)，進行神經功能評分，標準如下:正?；顒?分;不能充分伸展左前肢1分;向左側轉圈2分;向左側傾倒3分;不能自發(fā)行走，意識障礙4分。神經功能評分在1～3分的大鼠用于實驗。0、4分者或者術中死亡者淘汰，重新在未選入的大鼠中隨機抽取手術。②行為檢查:由3位參加實驗的人員分別以單盲法對實驗的大鼠進行打分和記錄。在造模手術后和1/2 h進行行為檢查。評分標準［6］:提尾使其離地30 cm時，左肩部內旋、左前肢屈曲、內收(正常大鼠兩前肢對稱向地伸開)。根據(jù)其嚴重程度，最高為4分，正常為0分。將大鼠置于平滑地板上，檢查大鼠抵抗推動時的阻力，分別推其左、右肩向對側移動，有左側阻力下降(正常大鼠兩側推動的阻力明顯對稱)現(xiàn)象?？筛鶕?jù)下降程度評1～3分，正常評分為0分。觀察大鼠兩前肢肌力，爬行時向左劃圈。爬板時總是落向左側。將動物兩前肢置于一金屬網上，然后輕提起大鼠，檢查兩前肢肌力。正常左右對稱，如有一側前肢肌力下降者，根據(jù)下降程度評為1～3分，正常評分為0分。上述行為檢查總積分為0～10分。積分越高說明動物行為障礙越嚴重。

1.4.3 采血方法 采用斷尾采血方法。先刮凈尾毛，用溫水浸泡鼠尾3～5分鐘，酒精消毒鼠尾，固定器固定，在距尾末端3～5 cm處用無菌手術剪剪斷鼠尾。第一滴血棄用，留取以后的血液進紅頭管，每次取血1～1.5 ml，每組第二次采用心臟穿刺采血。注意:術中失血量超過3.5 ml的大鼠淘汰;采血前一定將尾部消毒干凈，防尾毛進入血清引起溶血;溶血標本淘汰。全血在2～8℃靜置1/2～1小時后1000轉離心機離心15分鐘，然后用移液器吸分離血清至2 ml離心管，標記筆注明標號，－70℃冰箱凍存。

1.4.4 ELISA實驗 首先從冰箱取出試劑盒和血清標本，室溫復溫平衡30分鐘。調配需稀釋的液體。分別設待測樣品、標準孔、空白孔，空白孔加樣品稀釋液100 μl，余孔分別加標準品或待測樣品100 μl，加樣時加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，不要產生氣泡，輕輕晃動混勻，酶標板加上覆膜。37℃恒溫箱溫育120分鐘。棄去液體，甩干，吸水紙上拍干，每孔加生物素標記抗體工作液100 μl，37℃恒溫箱溫育60分鐘，再次棄去液體，甩干，吸水紙上拍干，如此重復洗板3次每次浸泡1～2分鐘，200 μl每孔，甩干。每孔加入辣根過氧化物酶標記親和素工作液100 μl(空白對照孔不加)，37℃恒溫箱溫育60分鐘;棄去液體，甩干，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1～2分鐘，如此重復洗板5次。每孔先加入底物溶液90 μl，覆膜37℃避光顯色20～30分鐘，直至標準品出現(xiàn)明顯梯度的藍色改變(出現(xiàn)終止反應)。出現(xiàn)終止反應時，立即加終止液50 μl，顏色由藍色立即轉為黃色。最后以空白孔調零，在終止后15分鐘內，用450 nm波長酶標儀測量各孔的吸光值(OD值)，再根據(jù)標準品的濃度及對應的OD值，計算出標準曲線的直線回歸方程，根據(jù)樣本的OD值，在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，用重復測量的方差分析方法統(tǒng)計各組間及不同時間點的VEGF因子差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

由表1可見，手術組與假手術組VEGF，在1/2、2、3、6、12、24 h 時間點差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，而手術組與空白組 VEGF，在 1/2、2、3、6、12、24 h時間點差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，手術組不同時間點的比較發(fā)現(xiàn):VEGF在24 h的表達至峰值，與其他時間點比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。采用重復測量的方差分析對三組不同處理因素引起的VEGF表達的差異以及不同時間之間的差異進行分析，提示三組間差異有統(tǒng)計學意義(F=5.357，P ＜0.05)，8個時間點間的差異也有統(tǒng)計學意義(F=9.589，P ＜0.05)。圖1顯示VEGF在不同處理因素作用下的動態(tài)表達過程，VEGF自MCAO后1/2 h即開始表達，之后濃度逐漸升高，于24 h到達高峰。

表1 VEGF的動態(tài)變化 (pg/ml)

圖1 三組大鼠VEGF隨時間變化趨勢圖

3 討論

VEGF是一種內皮細胞特異性有絲分裂原，在體外可促進內皮細胞生長，在體內可誘導血管生成。缺氧是VEGF和VEGF受體(VEGFR)表達上調的強效誘發(fā)因素，VEGF是目前已知最強的血管通透性因子，主要作用于毛細血管后微靜脈和小靜脈，其作用是組織胺的5萬倍。在血管生成過程中，內皮細胞需表現(xiàn)一系列的復雜行為，包括增殖、遷移、細胞間黏附、排成直線及形成開放的管腔樣結構等，還包括血管基底膜及細胞外基質的降解。此過程需要多種因子參與，其中VEGF是主要的調控因子。VEGF可提高葡萄糖進入內皮細胞的能力，補充血管形成所需的高能量。有研究認為在VEGF增加血管通透性的信號傳導通路中 Src起重要作用［10，11］，和蛋白激酶C(PKC)、Raf-1-MEK-ERK1/2、一氧化氮合酶(NOS)等也有關。VEGF通過 NO和前列環(huán)素(PGI2)對調節(jié)血管通透性也很重要。

VEGF在多種中樞神經系統(tǒng)疾病中的作用已得到肯定，Sondell等［12］研究發(fā)現(xiàn)，VEGF能刺激神經軸突的生長和延長神經細胞的存活時間，VEGF在病理狀態(tài)下對中樞神經系統(tǒng)有保護作用。Samii等［13］用鏈脲霉素誘導大鼠Ⅰ型糖尿病模型，通過染色后觀測，脊神經和坐骨神經的神經纖維中VEGF呈強陽性表達。用神經生長因子治療的病理模型大鼠，周圍神經功能改變表現(xiàn)為Schwann細胞［14］和神經元中VEGF上調;中樞神經功能改變表現(xiàn)為小膠質細胞和神經元中VEGF上調，故推測VEGF可能對神經再生也起一定的保護作用。

VEGF在腦梗死發(fā)病過程中起著雙重作用，一方面它可使內皮細胞增殖并迅速形成新生血管，改善組織缺血缺氧環(huán)境，誘導小膠質細胞增生，故對腦缺血患者神經細胞的保護、側支循環(huán)的建立等方面起積極意義;另一方面，它增加腦血管與組織間隙及血腦屏障的通透性，引起腦水腫形成和加重，增加顱內壓，起到有害作用。所以在腦梗死患者中到底給予VEGF還是阻斷其作用不確切，這里有一個時機和劑量的問題需要解決，這個問題值得深入研究。Van Bruggen等［15］報道，在大鼠腦缺血早期短暫應用VEGF拮抗劑，可使腦水腫減輕。近年來的實驗發(fā)現(xiàn)糖皮質激素地塞米松對缺血半暗帶VEGF表達的抑制、對缺血再灌注腦組織血管內皮細胞VEGF表達的抑制、對腦水腫形成的抑制三者的時相點一致，推測地塞米松可通過VEGF間接減輕腦水腫程度。近年有報道稱，對缺血性疾病導入VEGF基因或給予重組人VEGF(rhuVEGF)可促進血管新側支循環(huán)的建立，可代替血管重建和搭橋術，故稱為“治療性血管成形術”分子搭橋術，這也說明了VEGF在新生血管形成方面的作用。VEGF在小鼠急性腦梗死模型的實驗性治療中已取得了階段性成果。Hayashi等［16］的研究表明，VEGF不僅可使梗死面積縮小，減輕腦水腫的形成，而且可局限神經元受損范圍的擴展。多種動物模型的實驗不斷深入地闡明VEGF的作用、機制，推動VEGF的應用逐漸走向臨床。了解VEGF在大鼠MCAO后的動態(tài)變化特點并找出其規(guī)律，準確控制VEGF進行干預的時間窗和干預程度，對腦梗死的診斷、治療必將起到重要的作用。

本實驗結果和相關文獻明確了VEGF在腦梗死后不同時間點的相關表達。VEGF因子在缺血性病變的病理過程中發(fā)揮著關鍵作用;它與其他因子如缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)、熱休克蛋白 70(Hsp70)、半胱天冬蛋白酶(Caspase3)在缺血性病變的恢復機制中互相協(xié)同。所以對于VEGF在缺血性腦血管病中的信號轉導途徑及其活性調節(jié)機制的闡明可能為缺血性腦血管病的治療提供了新的靶點。

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