蔣 力，侯 兵，崔珂釩，閔家新

(中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院胸外科，重慶 400037)

腫瘤的發(fā)生是多因素、多階段、多步驟的復(fù)雜過(guò)程。在本研究中，筆者綜合評(píng)價(jià)了重組人5型腺病毒在體外的抗腫瘤效應(yīng)，揭示了其對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Model 2300 CO2型細(xì)胞孵育箱(美國(guó)Shellab公司);移液器(德國(guó)Eppedorf公司)。A549細(xì)胞(由第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院腦外科夏永智博士惠贈(zèng));重組人5型腺病毒(商品名安柯瑞?，上海三維生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為20110401);RPMI 1640培養(yǎng)基、小牛血清均購(gòu)自GibcoPBRL公司;Transwell小室、MTT試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;TUNEL試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 A549 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

將復(fù)蘇后的A549細(xì)胞置含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，于5%CO2和37℃、飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁形態(tài)正常，生長(zhǎng)良好，隔天換液并傳代1次;細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、成活率大于95%時(shí)，以0.25%胰酶消化培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)單層細(xì)胞，將細(xì)胞懸液移入離心管內(nèi)，常溫下800～1000 r/min低速離心5 min，吸去上清液，加入無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞。在96孔板中分3組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每孔取3×105個(gè)/L細(xì)胞，放入孵育箱中培養(yǎng)24 h后用于轉(zhuǎn)染。

1.2.2 細(xì)胞增殖曲線測(cè)定

采用3－(4，5－二甲基噻唑－2)－2，5－二苯基四氮唑溴鹽(MTT)比色法檢測(cè)加入重組人5型腺病毒(質(zhì)量濃度分別為5，10，15，20μg/mL)培養(yǎng)時(shí) A549 細(xì)胞(試驗(yàn)組)12，24，48，72 h 時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞的存活率。以正常生長(zhǎng)的A549細(xì)胞為對(duì)照組。用含10%胎小牛血清的培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，接種到96孔板，每孔1000～10000個(gè)細(xì)胞，每孔體積200 μL，培養(yǎng)3～5 d后，每孔加MTT溶液(5 g/L)20 μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解，選擇490 nm波長(zhǎng)在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔吸光度值，試驗(yàn)結(jié)果用細(xì)胞存活率表示。細(xì)胞存活率(%)=試驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值×100% 。

1.2.3 細(xì)胞遷徙試驗(yàn)

將小室放入24孔培養(yǎng)板中，在上室加入300 μL預(yù)溫的無(wú)血清培養(yǎng)基，室溫下靜置15～30 min，使基質(zhì)膠水化，吸去剩余培養(yǎng)液，制備無(wú)血清細(xì)胞懸液(2～3×105個(gè)/mL);24孔板下室加入500 μL含20%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養(yǎng)基，取細(xì)胞懸液200 μL加入Transwell小室，注意防止下層培養(yǎng)液和小室間產(chǎn)生氣泡，常規(guī)培養(yǎng)12～24 h;取出小室，用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室一側(cè)的細(xì)胞，用手術(shù)刀將膜切下，用90%酒精常溫固定30 min，0.1%結(jié)晶紫常溫染色10 min，清水漂凈，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，取3～5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)。將上室液更換為質(zhì)量濃度為20μg/mL的重組人5型腺病毒培養(yǎng)液，重復(fù)以上試驗(yàn)步驟。

1.2.4 細(xì)胞周期檢測(cè)

將A549細(xì)胞分為對(duì)照組及試驗(yàn)組，每組12孔，接種到24孔板內(nèi)。24 h后，A549細(xì)胞試驗(yàn)組換為質(zhì)量濃度為20μg/mL的重組人5型腺病毒無(wú)血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)3 d后，以0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞，800 r/min離心5 min，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液漂洗，吹打成單細(xì)胞懸液，70%冷乙醇4℃下固定24 h，RNAase消化，碘化丙啶標(biāo)記，在激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm、檢測(cè)光波長(zhǎng)610 nm下用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.5 細(xì)胞凋亡試驗(yàn)

將A549細(xì)胞分別按每孔4×104個(gè)/mL、每組12孔接種到24孔板，共兩組。24 h后，一組12孔更換為質(zhì)量濃度為0.20μg/mL的重組人5型腺病毒無(wú)血清培養(yǎng)液，設(shè)為A549細(xì)胞試驗(yàn)組，其余為對(duì)照組。72 h后將細(xì)胞用3.7%中性福爾馬林固定10 min，經(jīng)100%，95%，70%梯度濃度的酒精各水化5 min，磷酸鹽緩沖液室溫蕩洗10 min，每孔滴加 50 μL Cytonin，室溫 30 min，DNase－free水洗 2 次，每次2 min，加入新鮮配置的3%H2O2溶液，室溫5 min，磷酸鹽緩沖液洗1 min，TdT標(biāo)記緩沖液室溫孵育5 min，每孔滴加50 μL標(biāo)記反應(yīng)混和液，37℃ 1 h后用TdT終止緩沖液室溫作用5 min，倒置熒光顯微鏡下觀察，綠色熒光顆粒者為凋亡細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 重組人5型腺病毒對(duì)細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果見表1。

表1 不同質(zhì)量濃度重組人5型腺病毒對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響(%，)

表1 不同質(zhì)量濃度重組人5型腺病毒對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響(%，)

注:與對(duì)照組相比，＊P＜0.01;與同一濃度前一時(shí)相比較，△P＜0.01。

2.2 細(xì)胞遷徙試驗(yàn)

結(jié)果見圖1。重組人5型腺病毒能顯著抑制A549細(xì)胞的遷徙能力。正常A549細(xì)胞與加入20μg/mL重組人5型腺病毒培養(yǎng)的A549細(xì)胞比較，遷徙試驗(yàn)結(jié)果有顯著性差異(P＜0.01)。

圖1 重組人5型腺病毒對(duì)A549細(xì)胞遷徙的影響

2.3 重組人5型腺病毒對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

以含重組人5型腺病毒質(zhì)量濃度為20μg/mL培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h后，經(jīng)細(xì)胞周期測(cè)定，試驗(yàn)組G0/G1期A549細(xì)胞所占比例為77.41%，S 期細(xì)胞 22.41%，G2－M 期細(xì)胞占 2.19%;對(duì)照組 G0/G1期A549細(xì)胞所占比例為76.97%，S期細(xì)胞占9.21%，G2－M期細(xì)胞占13.62%。結(jié)果顯示，試驗(yàn)組細(xì)胞被阻滯于S期，細(xì)胞增殖顯著被抑制(P ＜0.01)。結(jié)果見圖 2。

圖2 重組人5型腺病毒對(duì)A549細(xì)胞周期分布的影響

2.4 重組人5型腺病毒對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

以含重組人5型腺病毒質(zhì)量濃度為20μg/mL的培養(yǎng)液培育A549細(xì)胞72 h后，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，加入重組人5型腺病毒培養(yǎng)后，A549細(xì)胞凋亡數(shù)較正常培養(yǎng)A549細(xì)胞明顯增加(n=20，P ＜0.01)，見圖 3。

圖3 重組人5型腺病毒對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

腫瘤形成是一個(gè)多因素、多基因參與的過(guò)程，其中p53基因的失活對(duì)腫瘤形成起著重要作用。p53基因與人類50%的腫瘤有關(guān)，目前發(fā)現(xiàn)的有肝癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、軟組織肉瘤、卵巢癌、腦瘤、淋巴細(xì)胞腫瘤、食道癌、肺癌、成骨肉瘤等[2]。重組人5型腺病毒是利用基因工程技術(shù)對(duì)人5型腺病毒(Ad5)進(jìn)行基因重組而得到的一種溶瘤腺病毒，其刪除了人5型腺病毒的E1B－55 kD和E3區(qū)19 kD基因片段，能在腫瘤細(xì)胞中特異性復(fù)制而最終溶瘤[3]。

重組人5型腺病毒注射液特異性殺死腫瘤細(xì)胞的原理有:直接在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制、包裝，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞裂解;增加受感染腫瘤細(xì)胞對(duì)由細(xì)胞因子等引起的免疫反應(yīng)的敏感性，加速受感染細(xì)胞的死亡;所表達(dá)的抗原誘發(fā)MHC I在被感染腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)，引導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)性的T細(xì)胞免疫反應(yīng);E1A區(qū)可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療的敏感性[4]。

本研究證實(shí)，重組人5型腺病毒在體外能明顯抑制A549細(xì)胞的生長(zhǎng)并促進(jìn)其調(diào)亡。但是，將重組人5型腺病毒制成臨床抗癌藥物仍需克服一些難題，如藥效的特異性及局部藥物濃度過(guò)低等。

[1]Kenneth R，Rog Lski，Svend O，et al.In Vivo Antitumor Activity of ONYX－015 Is Influenced by p53 Status and Is Augmented by Radiotherapy[J].Cancer Research，2000，60:1193－1196.

[2]Thomas Rothmann，Arnd Hengstermann，Noel J，et al.ONXY－015，Replication of ONYX－015，a Potential Anticancer Adenovirus，Is Independent of p53 Status in Tumor Cells[J].Journal of Virology，1998，72(12):9470－9478.

[3]Brett R，Dix，Sara J.Braithwaite.Does the antitumor adenovirus ONYX－015/dl1520 selectively target cells defective in the p53 pathway[J].Journal of Virology，2001，75(12):5443－5447.

[4]Cheng－Ta Yang，Liang You，Kazutsugu Uematsu，et al.P14ARF Modulates the cytolytic effect of ONYX－015 in mesothelioma Cells with wild－type p53[J].Cancer Research，2001(61):5959－5963.