昌國強(qiáng)，歐 伶，丁慶豹，鄭之明，王 麗，袁成凌

(1.華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237；2.中國科學(xué)院等離子體物理研究所 離子束生物工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031)

營養(yǎng)缺陷型菌株在工業(yè)微生物的設(shè)計(jì)育種、遺傳學(xué)及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有著重要作用[1]。不同的研究及實(shí)際應(yīng)用常常需要獲得某種特定營養(yǎng)缺陷型的突變株，然而特定營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選十分困難，需要經(jīng)過復(fù)雜的物理和化學(xué)誘變才能獲得。

離子束注入技術(shù)是20世紀(jì)80 年代中期研究出來的一種誘變技術(shù)[2]。與其它誘變源相比，離子束注入誘變可以在輕度損傷的情況下，獲得更高的突變率(較其它誘變高出1～2個數(shù)量級)和更廣的突變譜，因此被廣泛運(yùn)用于各種生物細(xì)胞誘變選育的研究。

大腸桿菌(Escherichiacoli)的胸苷酸(dTMP)代謝途徑[3]有兩條：第一條為從頭合成途徑，即尿苷酸(UMP)經(jīng)過一系列的代謝途徑，最后形成脫氧尿苷單磷酸(dUMP)，在胸苷酸合成酶(TS)的作用下生成脫氧胸苷單磷酸；另一條為補(bǔ)救途徑，可以直接從體外吸收胸腺嘧啶或者胸腺嘧啶核苷來合成胸苷酸。

作者在此采用低能離子束注入法誘變大腸桿菌，并利用甲氧芐啶(TMP)[4]定向篩選，獲得胸腺嘧啶(T)營養(yǎng)缺陷型的大腸桿菌突變菌株，再克隆出T營養(yǎng)缺陷型菌株TS基因[5]，通過基因重組技術(shù)構(gòu)建T-重組子，并測定其TS基因序列，與正常大腸桿菌的TS基因進(jìn)行對比，以鑒定突變株TS基因是否發(fā)生突變。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

E.coliDH5α，自行保存。

pMD-18T 載體，TAKARA生物技術(shù)公司；E.coliBL21(DE3)，Novagen。

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，根據(jù)需要另加入終濃度100 μg· mL-1羧芐青霉素鈉或50 μg· mL-1卡那霉素，固體培養(yǎng)時另加入17 g·L-1瓊脂。

GS培養(yǎng)基：(NH4)2HPO42.5 g·L-1，KH2PO41.5 g·L-1，NaCl 5.0 g·L-1，MgSO4·7H2O (20%溶液)0.5 mL·L-1，谷氨酸鈉 3.0 g·L-1，葡萄糖3.0 g·L-1。

GST培養(yǎng)基：(NH4)2HPO42.5 g·L-1，KH2PO41.5 g·L-1，NaCl 5.0 g·L-1，MgSO4·7H2O (20%溶液)0.5 mL·L-1，谷氨酸鈉 3.0 g·L-1，葡萄糖 3.0 g·L-1，胸腺嘧啶50 μg·mL-1。

1.2 試劑與儀器

DNA聚合酶、dNTP、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶，TAKARA生物技術(shù)公司；DNA回收試劑盒，天根生物技術(shù)公司；瓊脂糖、標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA (DNA Marker)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)，鼎國生物技術(shù)有限公司；低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白(Protein marker)，中國科學(xué)院上海生化所；胰蛋白胨、酵母粉。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

Mini MJ型PCR儀，DYCP-31型水平電泳槽，725型紫外光柵分光光度計(jì)，DY CZ-24 D型電泳儀，GL-312型UV檢測儀，JY92-Ⅱ型超聲破碎儀，低能離子注入儀(中國科學(xué)院等離子體物理研究所)。

1.3 菌株的誘變

1.3.1 菌懸液的制備

將大腸桿菌BL21于LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，濃度約為1×108cfu·mL-1。取10 mL發(fā)酵液離心得菌體，用0.01 mol·L-1的磷酸緩沖溶液(PBS)重懸。取0.1 mL 重懸菌液均勻涂布于無菌空白培養(yǎng)皿中，無菌風(fēng)吹干或自然晾干后立即進(jìn)行N+離子注入。

1.3.2 N+離子注入[6]

將上述涂菌培養(yǎng)皿放入離子束注入靶室進(jìn)行離子注入，注入能量為10 keV，靶室真空度為0.001 Pa，以8 s脈沖式注入，間隔為5 s，單次注入劑量為2.5×1013ions·cm-2。注入劑量(×2.5×1013ions·cm-2)分別為5、10、15、20、25、30、40、60、100。注入后立即用無菌緩沖溶液將培養(yǎng)皿上菌體沖洗下來。

以經(jīng)過真空處理而不注入離子束的菌株作為對照。

1.3.3 誘變后處理

將經(jīng)離子束注入過的樣品培養(yǎng)皿在無菌條件下用無菌PBS洗脫，收集洗脫液，經(jīng)適當(dāng)稀釋后涂布于含胸腺嘧啶的LB培養(yǎng)皿，置于培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率。

1.4 菌株的篩選

1.4.1 T營養(yǎng)缺陷型菌株的濃縮

將經(jīng)離子束注入后的培養(yǎng)皿用PBS洗脫，取一定體積洗脫液，接種于含T的GS 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)一段時間，再加入一定濃度的甲氧芐啶(TMP)，培養(yǎng)過夜，菌液離心后用PBS重懸。

1.4.2 T營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選

取200 μL重懸菌液涂布于LB+T的培養(yǎng)皿上作為母板，置于培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)24 h，用平板影印法將母板上單菌落分別影印到GS+T+TMP培養(yǎng)皿及GS+TMP對照培養(yǎng)皿上，37℃培養(yǎng)24 h，將在GS+TMP培養(yǎng)皿上不生長、而在GS+T+TMP培養(yǎng)皿上生長的單菌落挑出，即為T營養(yǎng)缺陷型菌株。將篩選出來的T營養(yǎng)缺陷型菌株保存在終濃度15%的甘油儲存液中并置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 T營養(yǎng)缺陷型菌株的鑒定

為了進(jìn)一步研究T營養(yǎng)缺陷型菌株的生理特性，掌握營養(yǎng)缺陷的代謝機(jī)理，推測作為胸苷酸途徑代謝的限速酶——胸苷酸合成酶基因發(fā)生突變，導(dǎo)致該酶失活，這可能是營養(yǎng)缺陷的原因。因此對該酶基因進(jìn)行遺傳學(xué)鑒定。

胸苷酸合成酶基因(ThyA)序列參見Genbank[7]。按文獻(xiàn)[8]方法提取突變菌基因組，以其作為模板設(shè)計(jì)5′端引物 GCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGA-AACAGTATTTAG、3′端引物 GGAATTCTTAGATAGCCACCGGCGCTTTAATG，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，下劃線處分別為XbaⅠ和EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min后，PCR循環(huán)：94℃變性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸60 s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物的純化按瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明進(jìn)行。

將回收的目的基因與pMD-18T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含羧芐青霉素鈉的LB平板上，過夜培養(yǎng)。挑單克隆菌株TPMD 1，提取質(zhì)粒，進(jìn)行限制性內(nèi)切酶分析鑒定，如確定為陽性，進(jìn)一步測定DNA序列。

1.4.4 DNA測序及序列分析

DNA測序工作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成，雙向測序，確保測序的準(zhǔn)確性。序列分析由美國國立生物技術(shù)信息中心相應(yīng)站點(diǎn)http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi在線完成，通過在線運(yùn)行blastn和blastx，比對突變基因及其相對應(yīng)的多肽序列，了解基因突變位點(diǎn)，并運(yùn)用Discovery studio分子模擬軟件考察TS蛋白在突變前后的三維結(jié)構(gòu)變化，研究其TS變異后失活原因。

2 結(jié)果與討論

2.1 N+離子注入對菌株存活率的影響(圖1)

圖1 N+離子注入對菌株存活率的影響

由圖1可知，在N+注入劑量小于15×2.5×1013ions·cm-2時，隨N+注入劑量的增加，菌株存活率迅速降低；當(dāng)劑量達(dá)到15×2.5×1013ions·cm-2后，存活率有短暫的回升，后又逐漸下降，整個過程呈“馬鞍型”變化曲線，注入劑量超過100×2.5×1013ions·cm-2后存活率趨于零。這可能是由于離子注入細(xì)胞的射程較短，離子束侵蝕細(xì)菌細(xì)胞表面，大量自由基在胞內(nèi)堆積，破壞胞內(nèi)活性大分子，使得細(xì)菌迅速死亡；但是當(dāng)劑量增加到一定強(qiáng)度時，進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)的離子會在菌體外形成一種庫侖斥力，在胞外形成保護(hù)屏障，阻礙離子靠近菌體細(xì)胞，細(xì)菌存活率開始上升；但是劑量超過一定限度，細(xì)胞又會失去保護(hù)屏障，開始慢慢死亡。因此，選擇“鞍峰”位置劑量能獲得最大突變率。本實(shí)驗(yàn)選擇最佳誘變注入劑量為20×2.5×1013ions·cm-2，此時，菌株的存活率約為25%。

2.2 甲氧芐啶對突變菌篩選的影響

在篩選過程中為提高突變菌比例，需對誘變后的培養(yǎng)液進(jìn)行適當(dāng)濃縮處理。目前常用的細(xì)菌濃縮法為青霉素濃縮法[9]，但該方法不能定向選育，不方便后續(xù)的篩選工作。

本實(shí)驗(yàn)選用針對性更強(qiáng)的甲氧芐啶(TMP)作為篩選試劑。四氫葉酸是胸苷酸合成酶催化dUMP生成dTMP的供甲基體，四氫葉酸的供應(yīng)不足，胸苷酸合成酶就無法發(fā)揮其催化作用，胸苷酸的正常代謝途徑中斷，菌體無法自身合成胸苷酸，在無外源胸腺嘧啶時可導(dǎo)致細(xì)菌死亡。TMP的作用是能與二氫葉酸還原酶發(fā)生不可逆結(jié)合，阻止體內(nèi)四氫葉酸的生成，胸苷酸正常代謝途徑受TMP的抑制作用，細(xì)菌無法正常生長。而T營養(yǎng)缺陷型菌株則不受TMP的影響，當(dāng)培養(yǎng)基中添加了T或者胸腺嘧啶核苷(TR)時，能攝取T或TR來合成胸苷酸，滿足T營養(yǎng)缺陷型菌株正常的生長需求。因此，T營養(yǎng)缺陷型菌株在含甲氧芐啶的GST培養(yǎng)基中能正常生長，而野生型菌株將會受到抑制。

通過測定T營養(yǎng)缺陷型突變菌株在有無TMP時光密度(有TMP時為OD600′，無TMP時為OD600)的比值(OD600′/OD600)，考察TMP濃度對菌株生長的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 TMP濃度對突變菌生長的影響

OD600′/OD600太大，說明TMP沒有起到篩選的作用；OD600′/OD600太小，說明TMP在抑制原始菌株生長的同時，也一并抑制了突變菌株。從圖2可知，OD600′/OD600為0.3左右所對應(yīng)的TMP濃度較佳，約為50 μg·mL-1。

2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及重組菌ThyA基因的檢測(圖3)

圖3 PCR(a)及pMD-18T-ThyA(b)雙酶切鑒定結(jié)果

由圖3可知，突變菌與原始菌ThyA基因的PCR擴(kuò)增后，回收產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，目的基因大小為795 bp；重組克隆載體pMD-18T-ThyA雙酶切后瓊脂糖電泳，在800 bp和2500 bp附近都有條帶出現(xiàn)，說明克隆質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4 突變基因的測序及其突變位點(diǎn)的定位

分別測定原始菌株和突變菌株目的基因，并將測序結(jié)果與Genbank基因庫的E.coliTS基因序列比對，鑒定出突變位點(diǎn)為第173個堿基由AT→CG，對應(yīng)的氨基酸由谷氨酸(E58)突變?yōu)楸彼?A58)。谷氨酸為極性氨基酸，并且在同源性基因比對中發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)為高度保守位點(diǎn)，如圖4所示。

圖4 TS保守區(qū)域比對圖

圖4為TS氨基酸同源保守序列比對圖，來源于NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫；此圖黑體字符為TS保守區(qū)域，帶#號標(biāo)記的氨基酸位點(diǎn)為TS氨基酸序列高度保守位點(diǎn)。在第二個#處為E.coliTS酶蛋白第58個氨基酸位點(diǎn)——酸性氨基酸谷氨酸(E58)，為酶活性位點(diǎn)區(qū)域，在酶催化過程中提供一個良好的催化環(huán)境，并傳遞質(zhì)子，發(fā)揮著重要作用；E58突變?yōu)锳58后，酶活性局部區(qū)域的極性環(huán)境發(fā)生巨大改變，催化反應(yīng)中的質(zhì)子化與去質(zhì)子化無法順利進(jìn)行，酶活性下降。

在軟件分析過程中還發(fā)現(xiàn)，E58突變?yōu)锳58后，E58附近的另一氨基酸活性位點(diǎn)苯丙氨酸(F176)的空間位置發(fā)生了變化，如圖5所示。

Glu58與Phe176突變前用標(biāo)記，突變后用標(biāo)記

由圖5可知，F(xiàn)176的側(cè)鏈苯環(huán)基團(tuán)在TS變異后明顯朝著空間位置突起，占據(jù)了酶活性部位的空間，直接導(dǎo)致酶催化反應(yīng)底物在活性區(qū)域中無法處于正確的位置，甚至阻止了底物進(jìn)入到活性部位。這樣TS酶活性進(jìn)一步降低，甚至失去活性。

3 結(jié)論

采用低能N+離子注入誘導(dǎo)大腸桿菌，通過TMP定向篩選得到T營養(yǎng)缺陷型菌株。應(yīng)用遺傳學(xué)方法，鑒定出ThyA基因確實(shí)發(fā)生突變，突變位點(diǎn)為第173位堿基由AT→CG，相應(yīng)的氨基酸由谷氨酸(E58)突變?yōu)楸彼?A58)，通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫TS氨基酸同源保守序列的比對，以及E58在ThyA蛋白三維結(jié)構(gòu)中的位置[10]，了解E58為高度保守位點(diǎn)，在酶反應(yīng)過程中直接或者間接地參與催化反應(yīng)。運(yùn)用Discovery studio分子模擬軟件，比對TS變異前后蛋白三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)變異蛋白的E58附近的氨基酸位置有移位現(xiàn)象，其中F176的側(cè)鏈苯環(huán)結(jié)構(gòu)向活性空穴空間突出明顯。E58的變異與F176的空間移位均導(dǎo)致酶催化活性的喪失。為進(jìn)一步研究T營養(yǎng)缺陷型菌株中核苷酸代謝及相關(guān)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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