彭 哲，張嗣良

(華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237)

萬古霉素是由東方擬無枝酸菌(Amycolatopsisorientalis)產(chǎn)生的一種糖肽類抗生素，對(duì)青霉素 G和多種抗生素耐藥的金黃色葡菌球菌、表球菌以及溶血性鏈球菌、草綠色鏈球菌、肺炎球菌及腸球菌等均有強(qiáng)大的抗菌作用，對(duì)厭氧的難辨梭狀芽孢桿菌亦有較好的抗菌作用，對(duì)炭疽桿菌、白喉?xiàng)U菌等亦敏感[1]。20世紀(jì)80年代隨著β-內(nèi)酰胺類抗生素的大量使用，由甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(MRSA)所引起的感染逐漸流行，萬古霉素是目前臨床上用于治療由MRSA引起的嚴(yán)重感染疾病的重要藥物，愈來愈引起人們的重視[2]。無機(jī)鹽在萬古霉素的發(fā)酵生產(chǎn)過程中有著顯著的作用[3]，培養(yǎng)基中加入CaCl2、CuSO4·5H2O可以促進(jìn)萬古霉素的產(chǎn)生[4]；不同的微量金屬離子對(duì)萬古霉素的產(chǎn)生影響不同；亮氨酸、酪氨酸、天冬氨酸是萬古霉素的前體物質(zhì)[5]。

對(duì)發(fā)酵過程金屬離子的篩選優(yōu)化方法有很多。部分因子設(shè)計(jì)法是一種2水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，能夠通過比全因子實(shí)驗(yàn)次數(shù)少得多的實(shí)驗(yàn)，從大量影響因子中篩選出重要的因子，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合出一次多項(xiàng)式，然后通過最速上升實(shí)驗(yàn)(Steepest ascent design)確定最大響應(yīng)區(qū)域，以便利用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化[6]。

中心組合設(shè)計(jì)是在全因子設(shè)計(jì)或部分因子設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上添加2k個(gè)軸向點(diǎn)和中心點(diǎn)，以得到更為精確的實(shí)驗(yàn)預(yù)測模型[7]。

付啟偉等[8]應(yīng)用26-2部分因子設(shè)計(jì)法優(yōu)化了StreptomycesspiramyceticusWSJ-1-195發(fā)酵生產(chǎn)必特螺旋霉素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，必特螺旋霉素的效價(jià)從173 μg·mL-1提高到 1880 μg·mL-1。熊智強(qiáng)等[9]應(yīng)用中心組合設(shè)計(jì)對(duì)鏈霉菌702搖瓶培養(yǎng)紅谷霉素進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)酵液紅谷霉素效價(jià)達(dá)到1500 μg·mL-1，比優(yōu)化前提高了3.08倍。

作者在此依次通過部分因子析因設(shè)計(jì)、最速上升實(shí)驗(yàn)、中心組合設(shè)計(jì)，并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件 Minitab對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，確定東方擬無枝酸菌發(fā)酵48 h生產(chǎn)萬古霉素的培養(yǎng)基中微量金屬離子的濃度，以期為萬古霉素的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種

東方擬無枝酸菌(Amycolatopsisorientalis) V-0704由華北制藥華勝公司提供。

1.2 培養(yǎng)基

分離平板(斜面)培養(yǎng)基，即高氏1號(hào)合成培養(yǎng)基(g·L-1)：可溶性淀粉20，NaCl 0.5，KNO31，K2HPO4·3H2O 5，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，瓊脂粉 15，pH值7.2～7.4。

種子培養(yǎng)基(g·L-1)：酵母粉 3，麥芽提取物 3，蛋白胨 11，葡萄糖 17，pH值6.8。用工業(yè)用水配制。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：麥芽糖20，葡萄糖15，玉米油15，酵母粉0.568，棉籽餅粉6.98，黃豆餅粉23.3。用工業(yè)用水配制，0.1 MPa、121℃下滅菌20 min。

1.3 培養(yǎng)方法

分離平板培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)時(shí)間依菌落的生長情況而定。

種子搖瓶培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度28℃，裝液量40 mL/750 mL，搖床轉(zhuǎn)速220 r·min-1，培養(yǎng)時(shí)間22～24 h(視菌體生長情況而定)，采用孢子接種培養(yǎng)。

發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度33℃，裝液量20 mL/250 mL，接種量6%，搖床轉(zhuǎn)速250 r·min-1，培養(yǎng)時(shí)間72 h。

1.4 檢測方法

取發(fā)酵液5.0 mL于100 mL容量瓶中，用pH值1.8的硫酸稀釋定容至刻度，搖勻，用雙層定性中速濾紙過濾；再用0.45 μm的微孔濾膜過濾。濾液用于HPLC檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 25-1部分因子析因設(shè)計(jì)

在單因子實(shí)驗(yàn)確定好因子及其范圍的基礎(chǔ)上進(jìn)行2水平篩選實(shí)驗(yàn)。

當(dāng)2k析因設(shè)計(jì)的因子個(gè)數(shù)增加時(shí)，所需的實(shí)驗(yàn)次數(shù)會(huì)迅速增加。本實(shí)驗(yàn)若選用25析因設(shè)計(jì)需要設(shè)計(jì)32次實(shí)驗(yàn)。部分因子析因設(shè)計(jì)是合理地假定某些高階交互作用可被忽略，而主效應(yīng)和低階交互作用的信息可以通過只做完全析因?qū)嶒?yàn)的一部分求得。25-1部分因子析因設(shè)計(jì)是在2水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用有5個(gè)實(shí)驗(yàn)因子的每個(gè)實(shí)驗(yàn)組合重復(fù)2次的1/2部分實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。是在忽略三階以上的相互作用的基礎(chǔ)上進(jìn)行，它可以在考察單個(gè)因子的效用及2因子的效用時(shí)沒有偶聯(lián)重疊的相，并且每個(gè)組合重復(fù)了2遍，這樣可以估計(jì)由略微不同的實(shí)驗(yàn)條件導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)誤差。以實(shí)驗(yàn)誤差為基準(zhǔn)，確定數(shù)據(jù)分析中觀測到的差異是否為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的不同。這對(duì)于實(shí)驗(yàn)因子的篩選十分重要[7]，本實(shí)驗(yàn)采用的設(shè)計(jì)完全符合實(shí)驗(yàn)的要求。

本實(shí)驗(yàn)嘗試?yán)?5-1部分因子析因設(shè)計(jì)從所選的5個(gè)因子(5因子的編碼與實(shí)際濃度見表1)中篩選出對(duì)效價(jià)影響最顯著的幾個(gè)因子，再對(duì)所選出的因子進(jìn)行更為細(xì)致的優(yōu)化，25-1部分因子析因設(shè)計(jì)結(jié)果見表2。

表1 25-1部分因子析因設(shè)計(jì)的因子編碼與實(shí)際濃度

表2 25-1部分因子析因設(shè)計(jì)結(jié)果

對(duì)25-1部分因子析因設(shè)計(jì)用Minitab統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件在置信度為95%下進(jìn)行方差分析，以P值<0.05認(rèn)為有顯著作用，結(jié)果見表3。

表3 25-1部分因子析因設(shè)計(jì)的方差分析

由表3可以看出，在忽略三階及更高階交互作用的情況下，Co2+及Mo6+有顯著作用。由于Co2+、Mo6+的效用顯示為負(fù)值，因此下一步選取Co2+、Mo6+為主要因素進(jìn)行最速上升實(shí)驗(yàn)時(shí)要向金屬離子濃度減小的方向進(jìn)行。

2.2 確定方向的全因子實(shí)驗(yàn)

為確定Co2+、Mo6+兩因子的搜索方向，進(jìn)行22的全因子實(shí)驗(yàn)，并增加5次在中心點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)作為曲面曲度的驗(yàn)證。其它因子的濃度都固定在中心點(diǎn)。確定方向的全因子實(shí)驗(yàn)的因子編碼與實(shí)際濃度見表4，結(jié)果見表5，方差分析見表6。

表4 確定方向的全因子實(shí)驗(yàn)的因子編碼與實(shí)際濃度

表5 確定方向的全因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 確定方向的全因子實(shí)驗(yàn)的方差分析

由表6可以看出，交互作用和二次項(xiàng)都不顯著，而線性非常顯著，彎曲的P值大于0.05，可以認(rèn)為此設(shè)計(jì)并沒有位于彎曲的曲面上，并且Co2+、Mo6+對(duì)響應(yīng)的影響有可加的效應(yīng)。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行規(guī)范變量的一階模型擬合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該模型的相關(guān)性很好，失擬不顯著，故確定該模型能很好地?cái)M合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

擬合的一階模型為：Y(U·mL-1)=3175-61.5X3-71.25X4+8.7X3X4。

2.3 最速上升實(shí)驗(yàn)

擬合的一階模型中Mo6+、Co2+的系數(shù)都是負(fù)的，因此要離開設(shè)計(jì)中心沿最速上升路徑移動(dòng)，就要沿Co2+、Mo6+濃度減小的方向移動(dòng)。設(shè)Mo6+的步長為λ1，由公式λ2=61.5λ1/71.25可求出Co2+的步長λ2。

最速上升實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7。

表7 最速上升實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表7可以看出，由原點(diǎn)向濃度減小的方向搜索時(shí)，從原點(diǎn)到(原點(diǎn)+5λ)實(shí)驗(yàn)組效價(jià)逐漸升高，然后下降，認(rèn)為最優(yōu)點(diǎn)在(原點(diǎn)+3λ)～(原點(diǎn)+7λ)之間。因此，選擇1.5×10-5～3.5×10-5g·mL-1金屬離子進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)。

2.4 中心組合設(shè)計(jì)

中心組合設(shè)計(jì)的因子編碼與實(shí)際濃度見表8。

表8 中心組合設(shè)計(jì)的因子編碼與實(shí)際濃度

表9是帶有4個(gè)軸向點(diǎn)、5個(gè)中心點(diǎn)的可旋轉(zhuǎn)的中心組合設(shè)計(jì)結(jié)果，方差分析見表10。

表9 中心組合設(shè)計(jì)結(jié)果

表10 中心組合設(shè)計(jì)的方差分析

由表10可以看出，模型的失擬P值大于0.05，所擬合的規(guī)范變量的二次多項(xiàng)式失擬很小，98.2%的數(shù)據(jù)可以用該模型來解釋。

中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)面圖見圖1。

圖1 中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)面圖

3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由模型通過Minitab統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件計(jì)算得到Mo6+、Co2+的最佳濃度為2.486×10-5g·mL-1，效價(jià)預(yù)測值為4947.31 U·mL-1。

對(duì)比添加金屬離子及未加金屬離子的搖瓶培養(yǎng)結(jié)果，如表11所示。

表11 金屬離子添加與否對(duì)萬古霉素效價(jià)的影響

由表11可知，添加金屬離子搖瓶培養(yǎng)72 h的萬古霉素平均效價(jià)達(dá)到4946 U·mL-1，較未加金屬離子提高了17%。

4 結(jié)論

利用25-1部分因子析因設(shè)計(jì)考察了所選的5種微量金屬離子對(duì)萬古霉素的影響，篩選出Mo6+、Co2+為主要的影響因子；然后通過最速上升實(shí)驗(yàn)確定了Co2+、Mo6+的適宜濃度范圍；在此基礎(chǔ)上利用中心組合設(shè)計(jì)確定Co2+、Mo6+的最佳濃度為2.486×10-5g·mL-1，并對(duì)此結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。優(yōu)化后東方擬無枝酸菌搖瓶培養(yǎng)72 h后的萬古霉素平均效價(jià)從4206 U·mL-1提高到4946 U·mL-1，提高了17%。

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