王 胤

(西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400716)

煙曲霉(Aspergillusfumigatus)系子囊菌綱(Ascomycetes)曲霉屬的真菌，在自然界中分布廣泛。其分生孢子漂浮在空氣中，通過呼吸道進(jìn)入人體，主要引起肺部感染，進(jìn)而引起侵襲性曲霉病[1]。研究表明其代謝產(chǎn)物具備一定開發(fā)為活性藥物的潛力，迄今為止已從煙曲霉代謝產(chǎn)物中分離出多個(gè)化合物，但由于毒性較大或藥理活性一般、產(chǎn)物量甚微等原因，開發(fā)難度很大[2]。近年來發(fā)現(xiàn)其中一些化合物具有新的藥理活性[3～6]，尤其在抗腫瘤等方面有著較為積極的意義，既可用來研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移的機(jī)制，又可通過結(jié)構(gòu)改造以降低副作用獲得全新的抗腫瘤藥物。

作者在此對煙曲霉次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行了初步活性研究，擬為進(jìn)一步確定其活性單體成分奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

小牛血清(FCS)，杭州四季清公司；RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基，Hyclone公司；DMSO，Sigma公司；MTT[四氮唑鹽，3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide]。

My Cycler Thermal Cycler型PCR儀、Model 680型酶標(biāo)儀，美國BIO RAD；DYY-8C型雙向電泳儀，北京六一；KYC-1102型搖床，上海?，?；微量高速離心機(jī)，長沙湘儀。

1.2 菌株與培養(yǎng)基

菌株從三峽庫區(qū)土壤中分離得到，命名為IMBSX-28，經(jīng)鑒定為煙曲霉(Aspergillusfumigatus)。

發(fā)酵培養(yǎng)基(馬鈴薯-葡萄糖液體培養(yǎng)基，PD培養(yǎng)基)：取去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加水1 L煮沸30 min，濾去馬鈴薯塊，將濾液補(bǔ)足至1 L，加葡萄糖20 g，滅菌30 min。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，加水至1 L，溶解滅菌30 min。

改良馬丁培養(yǎng)基：胰蛋白胨5 g，酵母浸出物2 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀1 g，七水硫酸鎂0.5 g，瓊脂20 g，加水至1 L，溶解滅菌30 min。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離純化與鑒定

采用平板法和稀釋劃線法在PDA平板上對菌株進(jìn)行分離純化。通過形態(tài)學(xué)分析、對提取菌體rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增再進(jìn)行ITS序列分析[7]，鑒定該菌為Aspergillusfumigatus。

1.3.2 菌株發(fā)酵

將純化后的菌株涂到PDA平板上生長7 d，挑取適量菌體至裝有50 mL已滅菌 PD培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，在28℃、220 r· min-1條件下發(fā)酵培養(yǎng)7 d。共發(fā)酵140瓶。

1.3.3 發(fā)酵產(chǎn)物的提取

將發(fā)酵7 d的菌體與發(fā)酵液離心過濾。將發(fā)酵液濃縮2/3，加乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液濃縮至干，得煙曲霉胞外次級代謝產(chǎn)物乙酸乙酯部分。菌體加入甲醇進(jìn)行破碎并萃取3次，每次24 h，合并萃取液，得煙曲霉胞內(nèi)次級代謝產(chǎn)物，減壓濃縮至不含甲醇，再加入乙酸乙酯提取，得到菌體提取物浸膏。

1.3.4 抗菌活性分析

用甲醇將發(fā)酵液與菌體乙酸乙酯提取部分濃度調(diào)至1 mg · mL-1。抗菌活性采用瓊脂—紙片擴(kuò)散(KB)法測定。指示菌包括大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和白色念珠球菌(Candidaalbicans)。指示細(xì)菌和指示真菌分別用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。用100 μg · mL-1卡那霉素和50 μg · mL-1制菌霉素作為抗菌實(shí)驗(yàn)的陽性對照。通過觀察煙曲霉次級代謝產(chǎn)物對指示細(xì)菌和指示真菌生長的抑制來分析抗菌活性。

1.3.5 抗腫瘤活性分析

人肺癌A549細(xì)胞用 RPMI-1640培養(yǎng)基 (含 10%小牛血清)常規(guī)繼代，在通有5%(體積分?jǐn)?shù)) CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，于37℃培養(yǎng)。采用MTT法測試煙曲霉胞內(nèi)次級代謝產(chǎn)物對A549細(xì)胞增殖的抑制作用，同時(shí)通過顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測，初步判斷有無細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)、壞死性細(xì)胞毒等活性。

MTT法檢測抗腫瘤活性的具體步驟為：將處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞消化接種于96孔細(xì)胞板，細(xì)胞濃度為0.5×105個(gè)· mL-1，每孔200 μL，細(xì)胞接種48 h后加入20 μL不同濃度的煙曲霉次級代謝產(chǎn)物粗提液，使終濃度(μg · mL-1)分別為：400、200、100、50、25、12.5。每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，以同樣體積甲醇(代謝產(chǎn)物溶劑)作為陰性對照。繼續(xù)培養(yǎng)48 h。然后每孔加入10 μL 5 mg · mL-1MTT，37℃作用4 h，再加入100 μL DMSO，室溫下振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm 波長下測定吸光度OD值。根據(jù)OD值計(jì)算抑制率和半數(shù)抑制濃度IC50。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株分離與鑒定

煙曲霉菌體為墨綠色，在 PDA平板上培養(yǎng)2 d長出白色較長菌絲，第3 d后變成綠色并產(chǎn)孢。通過ITS序列分析，用ITS1和ITS4作為PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，并測序。通過美國 NCBI網(wǎng)站在線的 Genbank獲取與測得的序列相似的多個(gè)序列，相似度最接近的為99%。鑒定該菌為Aspergillusfumigatus。

2.2 抗菌活性(表1)

表1 煙曲霉IMBSX-28提取物抗菌活性分析

由表1可知，同等條件下煙曲霉發(fā)酵液與菌體的乙酸乙酯提取部分都具有一定的抗菌活性，但均限于對金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性菌)活性較強(qiáng)，對其它菌(革蘭氏陰性菌和真菌)則無活性。

2.3 抗腫瘤活性

以煙曲霉IMBSX-28提取物處理人肺癌A549細(xì)胞24 h，測定其對細(xì)胞增殖的抑制活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，煙曲霉菌體的乙酸乙酯提取部分在 200 μg · mL-1左右時(shí)能夠顯著抑制人肺癌 A549細(xì)胞的增殖，對癌細(xì)胞有很強(qiáng)的抑制作用，抑制率為100%，IC50為(228±0.52)μg · mL-1。而胞外發(fā)酵液的乙酸乙酯提取部分基本沒有抗人肺癌A549細(xì)胞的作用。

菌體提取物對A549細(xì)胞作用24 h后的細(xì)胞形態(tài)見圖1。

圖1 菌體提取物作用24 h后A549的細(xì)胞形態(tài)

2.4 討論

對于煙曲霉次級代謝產(chǎn)物的研究已有一些文獻(xiàn)報(bào)道，并且分離得到了不同的化合物。研究主要針對以下幾個(gè)方面：(1)不同來源煙曲霉的代謝產(chǎn)物不同。已有對從海洋分離出的煙曲霉進(jìn)行次級代謝產(chǎn)物研究的報(bào)道。(2)不同發(fā)酵條件獲得的代謝產(chǎn)物也不同。這方面文獻(xiàn)報(bào)道較少。(3)更好的分離純化技術(shù)的應(yīng)用，對以前獲得的很少量的物質(zhì)也可以進(jìn)行純化和結(jié)構(gòu)分析。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對于煙曲霉來說，更多的活性成分存在于胞內(nèi)，通過對其胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的研究應(yīng)該可以找到相應(yīng)的活性單體化合物。因此，后續(xù)研究將對活性較明顯的胞內(nèi)組分，通過萃取、柱層析、制備高效液相色譜等分離純化手段進(jìn)行分離與純化，得到不同的單體組分；然后再通過質(zhì)譜、核磁、紅外等不同手段，進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，了解相應(yīng)活性物質(zhì)的詳細(xì)結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論

通過對煙曲霉次級代謝產(chǎn)物活性的初步研究，發(fā)現(xiàn)煙曲霉的次級代謝產(chǎn)物成分比較復(fù)雜，其中很多具有藥理活性，特別是有一定的抗菌和抗腫瘤活性，且活性成分主要存在于胞內(nèi)。因此，煙曲霉次級代謝產(chǎn)物的研究對抗腫瘤藥物的開發(fā)具有一定意義。

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