孔 梅 李曉燕 蘇 旭 鄒 明 張 樺

嬰幼兒呼吸道病毒感染已成為主要的公共衛(wèi)生問題，而肺炎是發(fā)展中國(guó)家5歲以下兒童最主要的死亡原因。病毒是引起急性下呼吸道感染（AL?RI）中最主要的病原體，近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新的呼吸道病毒不斷被發(fā)現(xiàn)，包括人偏肺病毒（HMPV）、人冠狀病毒（CoV）、WU多瘤病毒以及人博卡病毒（HBoV）等病毒。除WU多瘤病毒是否為呼吸道致病原還存在爭(zhēng)議外，其余病毒已經(jīng)證實(shí)均為呼吸道致病原。筆者采集了202例住院患兒鼻咽分泌物，進(jìn)行16種呼吸道病毒檢測(cè)，以了解天津地區(qū)ALRI患兒中的病毒病原學(xué)現(xiàn)況。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取天津市兒童醫(yī)院2008年9月—2009年5月下呼吸道感染的住院患兒202例，年齡6 d～12歲（中位數(shù)6.0個(gè)月），男140例，女62例。其中肺炎患者179例（88.6%），支氣管炎23例（11.4%）。采集鼻咽分泌物后-70℃凍存，并盡快送至實(shí)驗(yàn)室。

1.2 病毒RNA/DNA提取 按照Nuclisens easyMAG自動(dòng)核酸提取儀（BioMetrix，法國(guó)）的說明書進(jìn)行，標(biāo)本液用量為200 μL，用50 μL洗脫液洗脫，-70℃保存。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR） 采用美國(guó)Ferman?tas公司試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄（按試劑盒說明書操作）。See?plexTMRV Detection kit（Seegene，韓國(guó)）多重PCR法檢測(cè)，A管檢測(cè)腺病毒（ADV），HMPV，CoV 229E/NL63，副流感病毒（PIV）1、2、3；B管檢測(cè)流感病毒（Flu）A、B，呼吸道合胞病毒（RSV）A、B，鼻病毒（RhinoV）A/B，CoV OC43/HKU1。陽性對(duì)照為試劑盒反應(yīng)液中已加的內(nèi)對(duì)照，陰性對(duì)照為無菌水。按試劑盒說明書操作。用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，上樣量為10 μL，使用試劑盒中提供的 RV-A Marker和RV-B Marker，置凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。HBoV按文獻(xiàn)[1]方法檢測(cè)NP-1基因片段。WU多瘤病毒檢測(cè)按文獻(xiàn)[2]法檢測(cè)VP2基因片段。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樣本致病性病毒檢出情況 202份樣本中151份（74.8%）標(biāo)本為致病性病毒陽性。RSV檢出數(shù)最高，為42.1%（85/202），其次為PIV 20.8%（42/202）和RhinoV19.8%（40/202）。其余病毒檢出較少，HBoV 14份、CoV 13份、Flu 9份、ADV 10份和HMPV 6份，典型電泳結(jié)果見圖1。85份RSV陽性檢出樣本中RSVB為83份，RSVA僅為2份。42份PIV中PIV3型為32份，PIV1為10份，未檢測(cè)到PIV2。9份Flu均為A型。13份CoV陽性檢出樣本中血清型OC43/HKU1為6份，229E/NL63為7份。

2.1.1 混合感染 2種以上病毒混合感染54份（26.7%），其中81.5%（44/54）為2種病毒混合感染，18.5%（10/54）為3種及以上病毒混合感染。15種病毒中混合感染率最高的是HBoV為64.3%（9/14），其次是RhinoV為62.5%（25/40），最低的是HMPV為16.7%（1/6）。

2.1.2 不同月份病毒檢出情況 9個(gè)月期間,標(biāo)本陽性檢出數(shù)從2008年12月開始突然增高，至2009年4月逐漸降低。RSV在2008年12月—2009年3月檢出率最高，與Flu流行高峰期較一致。PIV除9月末檢測(cè)到外，其余各月均有檢出，且在3月—5月較高。ADV冬季未檢測(cè)到，從2月開始出現(xiàn)。RhinoV、CoV和HBoV在9個(gè)月期間均有檢出，未有明顯的高峰期，見表1。

表1 不同月份致病性病毒檢出情況 （例）

2.1.3 各年齡段患兒病毒檢出情況 <6個(gè)月患兒病毒感染率80.4%（78/97），6～12個(gè)月為76.2%（32/42），12～36個(gè)月為 63.0%（29/46），≥36個(gè)月為70.6%（12/17）。各年齡段病毒陽性檢出率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.19，P>0.05），見表2。

表2 各年齡段患兒病毒檢出情況 例（%）

2.2 WU多瘤病毒檢出情況 202份樣本中有40例（19.8%）WU多瘤病毒陽性，年齡12 d～6歲(中位數(shù)11.4個(gè)月)，<6個(gè)月者17例（42.5%），6個(gè)月～1歲者7例（17.5%），1～3歲者14例（35%），≥3歲者2例（5.0%）。2009年3月檢出率最高，為52.2%（12/23），2008年12月為26.7%（8/30），2008年11月為22.2%（4/18），其余月份均有檢出。

3 討論

本研究檢測(cè)ALRI患兒鼻咽分泌物致病性病毒陽性率為74.8%，與Chung等[3]報(bào)道結(jié)果一致，但高于吳茜等[4]報(bào)道昆明患兒病毒檢測(cè)陽性率（27.2%）和莫運(yùn)波等[5]報(bào)道重慶兒童病毒檢測(cè)陽性率（47.27%）。國(guó)內(nèi)報(bào)道大多為免疫熒光法檢測(cè)7種呼吸道病毒，本研究病毒陽性率明顯高于國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道，考慮可能與采用的檢測(cè)方法以及檢測(cè)病毒種類數(shù)量不同有關(guān)。

本研究ALRI患兒中以RSV檢出率最高，這與廣州地區(qū)報(bào)道相同[6]，再一次證實(shí)了RSV確為兒童下呼吸道感染的最主要病原。除RSV外，PIV和RhinoV也是導(dǎo)致下呼吸道感染的較主要病原。有部分病毒有季節(jié)流行性，F(xiàn)lu雖為冬季流行，但其主要為門診上呼吸道感染致病病原，在下呼吸道感染住院患兒中檢出率僅為4.4%。WU多瘤病毒是否為呼吸道致病病原尚存在爭(zhēng)議，但本研究發(fā)現(xiàn)在下呼吸道感染患兒中陽性檢出率高達(dá)19.8%，應(yīng)當(dāng)引起關(guān)注。

6例HMPV陽性標(biāo)本中，僅有1例與RhinoV混合感染，在所有致病性病毒中混合感染率最低，表明HMPV與其他常見呼吸道病毒混合感染少見，與Regev等[7]的報(bào)道一致。HBoV與其他病毒或細(xì)菌的呼吸道病原的合并感染較常發(fā)生[8]，有報(bào)道與其他病原合并感染率可高達(dá)69.2%[9]，本研究結(jié)果也顯示HBoV與其他病毒混合感染率在所有病毒中最高，為64.3%。

2004年相繼發(fā)現(xiàn)了屬于第1組血清型的CoV HKU1和第2組血清型的CoV NL63，北京報(bào)道了CoV NL63在兒童中的感染[10]。本研究中同時(shí)檢測(cè)到這2種新出現(xiàn)的冠狀病毒，證實(shí)了CoV HKU1和NL63與天津地區(qū)嬰幼兒急性下呼吸道感染有關(guān)系。

本研究采用多重PCR的方法在提高陽性檢出率的同時(shí)還可以提高檢測(cè)效率，對(duì)病原體快速鑒別診斷、及早治療具有實(shí)用價(jià)值。因本研究?jī)H就9個(gè)月的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，還需進(jìn)行連續(xù)性的監(jiān)測(cè)，以更全面的了解各個(gè)病毒的流行趨勢(shì)。

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