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        灰樹花母種培養(yǎng)基的篩選及不同碳、氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

        2011-07-14 01:56:54孟翔鵬呂斯琦
        關(guān)鍵詞:母種樹花氮源

        孟翔鵬,馬 琳,呂斯琦,孫 靜

        灰樹花(Grifola frondosa)又名栗(子)蘑、貝葉多孔菌、蓮花菌、千(手)佛菌、云蕈、舞茸等。在分類學(xué)上隸屬于真菌門,擔(dān)子菌亞門,層菌綱,非褶菌目,多孔菌科,樹花屬。是近年來(lái)開發(fā)的珍奇藥食兩用菌之一,灰樹花因其均衡豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,顯著的醫(yī)療保健作用,而被譽(yù)為“食用菌王”,是極具發(fā)展前景的高檔食用菌。中國(guó)、歐美、日本等許多國(guó)家對(duì)灰樹花藥理作用的研究表明,灰樹花具有抗艾滋病病毒、抗癌、提高機(jī)體免疫、降血糖、刺激骨細(xì)胞生長(zhǎng)和修復(fù)等多種藥理活性[1-5]。筆者對(duì)不同母種培養(yǎng)基上灰樹花菌絲的生長(zhǎng)情況以及不同碳、氮源對(duì)灰樹花菌絲生長(zhǎng)的影響進(jìn)行分析比較,優(yōu)選出適宜菌種擴(kuò)種繁殖的培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)所需碳源、氮源等營(yíng)養(yǎng)條件。

        1 材料與儀器

        1.1 菌種 灰樹花(Grifola frondosa)購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。

        1.2 試劑 葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、果糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、硝酸氨(NH4NO3)、氯化氨(NH4Cl)、硝酸鈉(NaNO3)、亞硝酸鈉(NaNO2)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、硫酸鎂(MgSO4)、瓊脂均為國(guó)產(chǎn)分析純;馬鈴薯、麥麩、玉米粉為食品級(jí)。

        1.3 儀器 CLIN-250C型生化培養(yǎng)箱(天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);JB-CJ-2FXS潔凈工作臺(tái)(蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司);YXQ-LS-SⅡ型高壓滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司);YS2-H Nikon生物顯微鏡(上海蔡康光學(xué)儀器有限公司);AB204N萬(wàn)分之一電子天平(上海精密儀器有限公司);DSC-W570型數(shù)碼照相機(jī)(索尼數(shù)字產(chǎn)品有限公司)。

        2 方法

        2.1 供試培養(yǎng)基

        2.1.1 試管母種培養(yǎng)基 配方A(g/L):馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基;配方 B(g/L):綜合 PDA 培養(yǎng)基[7];配方 C(g/L):玉米粉 200,葡萄糖 20,瓊脂 20,水 1 000 mL;配方 D(g/L):麥麩 200,葡萄糖 20,瓊脂 20,水 1 000 mL;配方 E(g/L):葡萄糖 20,蛋白胨6,酵母粉 2,瓊脂 20,水 1 000 mL;配方 F(g/L):板栗木屑 200,葡萄糖 20,瓊脂 20,水 1 000 mL;配方G(g/L):馬鈴薯 200,板栗木屑 200,瓊脂 20,水1 000 mL;配方 H(g/L):馬鈴薯 200,麥麩 100,瓊脂20,水 1 000 mL;配方 I(g/L):葡萄糖 20,硝酸銨 4,磷酸二氫鉀2,硫酸鎂0.5,瓊脂20,水1 000 mL。

        2.1.2 母種平板培養(yǎng)基 基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L):磷酸二氫鉀1,硫酸鎂0.5,瓊脂20,水1 000 mL;以上培養(yǎng)基pH值約為6.0。

        2.2 平板培養(yǎng)基碳源實(shí)驗(yàn) 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加濃度為2g/L的蛋白胨,再分別添加20g/L的葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、果糖、陽(yáng)性對(duì)照(PDA)和空白對(duì)照(不加碳源),制成平板,無(wú)菌接種0.5 cm2大小的菌絲塊,25℃黑暗培養(yǎng),觀測(cè)其生長(zhǎng)狀態(tài)。

        2.3 平板培養(yǎng)基氮源實(shí)驗(yàn) 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加濃度為20g/L的蔗糖,再分別添加蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、NH4NO3、NH4Cl、NaNO3、NaNO2,空白(不加氮源)為對(duì)照,制成平板,其余操作同上。

        2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 將優(yōu)選出的碳源和氮源組合成新的培養(yǎng)基,加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,按上述操作,觀測(cè)其生長(zhǎng)狀態(tài),以上各組分別做5次重復(fù)。

        2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 菌絲日生長(zhǎng)速度(mm/d)=菌落平均半徑(mm)/生長(zhǎng)天數(shù)(d),實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,用最小顯著差數(shù)法(LSD)進(jìn)行比較。

        3 結(jié)果與分析

        3.1 灰樹花菌絲在9種不同的母種試管培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況 菌絲在9種試管培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng),但表現(xiàn)各有差異,結(jié)果見表1。

        表1 菌絲在9種不同的母種試管培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

        衡量菌種質(zhì)量?jī)?yōu)劣的兩個(gè)重要指標(biāo)是菌絲長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)弱和生長(zhǎng)速度(滿管時(shí)間)?;覙浠ňz長(zhǎng)勢(shì)特征中,菌落形態(tài)完整、色澤潔白、密度濃密、氣生菌絲量中等、菌絲粗壯、分支較多、可見鎖狀聯(lián)合等特征為菌種優(yōu)良特征,符合以上特征的培養(yǎng)基為灰樹花最佳篩選培養(yǎng)基[8]。由表1可見,培養(yǎng)基C滿管時(shí)間最短,但是菌絲色澤為淡紅棕色,表明老化嚴(yán)重,不利于其作為后續(xù)液體發(fā)酵或栽培的母種使用,棄去不選。培養(yǎng)基B滿管時(shí)間為18 d,除了C之外,為生長(zhǎng)速度最快的。除了未觀察到鎖狀聯(lián)合之外,其他特征均符合優(yōu)良菌種特征,因此,選擇B配方,即綜合PDA培養(yǎng)基為灰樹花母種最佳培養(yǎng)基。

        3.2 不同碳源對(duì)平板培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)的影響灰樹花菌絲在5種碳源平板培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng),但表現(xiàn)各有差異,結(jié)果見表2。果糖作為碳源時(shí),菌絲生長(zhǎng)速度最快,與陽(yáng)性對(duì)照(PDA)沒(méi)有差異,平均日生長(zhǎng)速度為2.46 mm/d,其次依次為葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和乳糖。果糖與葡萄糖相比,差異有極顯著意義,因此選擇果糖作為最佳碳源。

        表2 不同碳源對(duì)灰樹花菌絲生長(zhǎng)的影響

        3.3 不同氮源對(duì)平板培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)的影響由表3可以看出,灰樹花菌絲利用氮源的能力不盡相同,對(duì)有機(jī)氮源(牛肉膏、蛋白胨和酵母粉)的利用能力顯著高于無(wú)機(jī)氮源,最適氮源為牛肉膏,菌絲日均生長(zhǎng)速度2.09 mm/d,其次為生長(zhǎng)速度沒(méi)有顯著差異的蛋白胨和酵母粉;無(wú)機(jī)氮源中,利用銨態(tài)氮(NH4Cl和NH4NO3)的能力明顯高于硝態(tài)氮(NaNO2和NaNO3),相比較差異具有顯著性。

        表3 不同氮源對(duì)灰樹花菌絲生長(zhǎng)的影響

        3.4 最優(yōu)碳、氮源對(duì)平板培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)的影響 灰樹花菌絲在由果糖和牛肉膏組成的最優(yōu)培養(yǎng)基中無(wú)論菌絲生長(zhǎng)速度還是長(zhǎng)勢(shì),均表現(xiàn)良好:菌絲日均生長(zhǎng)速度為3.0 mm/d,菌落形態(tài)完整,菌絲潔白,密度為++++,菌落較厚。

        4 討論

        通過(guò)灰樹花母種培養(yǎng)基配方的研究,結(jié)果表明:不同配方的培養(yǎng)基對(duì)灰樹花菌絲生長(zhǎng)速度以及長(zhǎng)勢(shì)都有較大影響,在供試的9種不同母種培養(yǎng)基中,篩選出最適合灰樹花母種生長(zhǎng)的培養(yǎng)基是B配方,即PDA綜合培養(yǎng)基,滿管時(shí)間短、生長(zhǎng)速度快、長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)且不易老化。通過(guò)灰樹花平板培養(yǎng)基碳、氮源篩選的研究,結(jié)果表明:葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、果糖都可以作為灰樹花菌絲生長(zhǎng)的碳源,但對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度和長(zhǎng)勢(shì)表現(xiàn)有所不同,以果糖為碳源時(shí)日均生長(zhǎng)速度最快(2.46 mm/d),菌落完整、菌絲潔白、密度最厚,為最佳碳源。蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、NH4NO3、NH4Cl、NaNO3、NaNO2作為氮源時(shí),對(duì)灰樹花菌絲生長(zhǎng)速度和長(zhǎng)勢(shì)表現(xiàn)有所差異,以有機(jī)氮源最好,其中牛肉膏為氮源時(shí)日均生長(zhǎng)速度最快(2.09 mm/d),菌落完整、菌絲潔白、密度較厚為最佳氮源,無(wú)機(jī)氮源利用較差,其中以銨態(tài)氮為氮源明顯好于硝態(tài)氮。在以篩選出的最佳碳源(果糖)和最佳氮源(牛肉膏)組合成的新的培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)時(shí),結(jié)果表明:菌絲長(zhǎng)勢(shì)良好,日均生長(zhǎng)速度為3.0 mm/d,快于實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2中以果糖為碳源時(shí)的速度(2.46 mm/d),也快于實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.3中以牛肉膏為氮源時(shí)的速度(2.09 mm/d)。

        從差異顯著性上來(lái)說(shuō),有碳源組明顯優(yōu)于無(wú)碳源組;果糖組明顯優(yōu)于其他碳源組,原因可能是果糖在分子結(jié)構(gòu)上是一種酮糖,而葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖都含有葡萄糖分子,即都含有醛糖結(jié)構(gòu),灰樹花體內(nèi)代謝的酮糖酶多于醛糖酶,導(dǎo)致利用含有酮糖結(jié)構(gòu)的碳源速度較快。另外一個(gè)原因可能是由于在步驟2.2碳源實(shí)驗(yàn)中20g/L的果糖與2g/L的蛋白胨的碳/氮(C/N)相比其他4種糖的C/N更接近灰樹花最適C/N。

        [1]Hiroaki Nanba,Noriko Kodama,Douglas Schar.Effect of Maitake(Grifolafrondosa)glucanin HIV-infected patients[J].Mycoscience,2000,41(2):293-295.

        [2]Yuki Masuda,Noriko Kodama,Hiroaki Nanba.Macrophage J774.1cellisactivatedbyMZ-Fraction(Klasma-MZ)polysaccharide in Grifola frondosa[J].Mycoscience,2006,47(3):360-366.

        [3]李?;?灰樹花多糖的免疫作用實(shí)驗(yàn)研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2007,25(2):365-366.

        [4]周 偉,奚清麗,石根勇.灰樹花多糖對(duì)糖尿病小鼠的降血糖作用[J].江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué),2009,20(4):17-20.

        [5]Ashraf Saif,Ulrike Lindequist,Kristian Wende.Stimulating effects of Grifola frondosa on human osteoblastic cell cultures[J].J Nat Med,2007,61(1):231-238.

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